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标题:【求助】酵母表达上清浓缩问题

youreyes[使用道具]
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发表于 2013-8-19 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】酵母表达上清浓缩问题

各位大侠，小弟做酵母表达，诱导表达132h后，离心收集上清，没有浓缩跑胶，什么条带也没有，是怎么 回事？
用的载体是pic9k 菌是GS115，
是不是蛋白在沉淀里面，还是上清必须浓缩？
请教上清浓缩的简单方法，用硫酸铵浓缩的效果怎么样，具体步骤是什么？
小弟不胜感激
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-8-19 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以先简单的通过甲醇沉淀浓缩蛋白看SDS有没有条带，如果还没有可能是表达量太低，试试银染，或直接做western检测看有没有表达，如果还没有，就破碎细胞看看是不是在胞内表达了。
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2541[使用道具]
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发表于 2013-8-19 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

甲醇酵母表达即使表达量比较低的话应该也会有0.05-0.1mg/ml的，如果电泳目的条带都没法看到的话要么不表达要么表达量太低，如果这么低的表达量对于你后续的工作是否可以（蛋白的量能达到你的要求吗？）。楼上说的甲醇沉淀（是否是丙酮误写成甲醇了）可以试试，但是估计会沉淀下来很多盐，还是需要较多体积的水溶解。
转化后筛表达菌就做了一个吗？开始筛的时候应该多筛一些，看克隆间表达量有没有差异，选表达量高的
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youreyes[使用道具]
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发表于 2013-8-19 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

表达菌做了两个，不过银染时候我染的有点过头了，呵呵，都变黑了，第一次做，没有把握住分寸，
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2541[使用道具]
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发表于 2013-8-19 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，能不能交换一下菌株质粒，我有picZaA和x33，想交换你的pic9k和gs115
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-8-19 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酵母诱导表达后的上清至少要浓缩50倍，才可以看得到蛋白！
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youreyes[使用道具]
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发表于 2013-8-19 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有标准品吗？如果有先通过ELISA测一下表达量，如果没有就通过WB上样做梯度稀释，粗略估算一下表达量，然后再决定决定是否继续后续试验。
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xue258[使用道具]
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发表于 2013-8-19 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

三氯乙酸沉淀法，非常有效
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remenb[使用道具]
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发表于 2013-8-19 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对，同意ls的说法，先三氯乙酸沉淀用丙酮洗1遍，加样品缓冲液，然后跑去吧。
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30moonriver[使用道具]
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发表于 2013-8-19 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
乙醇浓缩法~
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