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标题:【求助】为什么没有荧光？

memory[使用道具]
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发表于 2013-8-20 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么没有荧光？

求各位帮帮忙， 我做的western blot，膜为什么没有荧光？
我转膜时看到marker也转到了膜上，可是我经过一抗二抗孵育后发光，为什么没有荧光呢？我用的是milipore的发光剂，应该很敏感的，但是连背景都没有荧光，为什么呢？
是不是虽然marker转到了膜上，而蛋白却没有转上去呢？
我一抗二抗孵育过程中完全按照操作要求来，难道是我的抗体出了问题？真的郁闷！
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-8-20 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

需要做好合适的对照先，尤其是当结果都是阴性时，需要注意有阳性对照，有了阳性对照的结果以后再讨论原因
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-8-20 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不一定是你操作的问题,有可能是蛋白太少,检测不到
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2013-8-20 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你要的结果是阳性，那么可能有两个原因一是蛋白量少、二是一抗浓度低

当然，膜的正反也要注意，荧光剂是否加在膜的蛋白面上
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am10[使用道具]
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发表于 2013-8-20 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

抗体是否有问题！
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-8-20 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
原因1;封闭有问题。可能性很大
原因2：抗体
原因3：蛋白样提取可有问题。
建议做内参，方便查找原因。
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发表于 2013-8-20 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
内参的一抗用和你检测目标蛋白相同种属的，如果内参正常排除二抗、操作和发光剂问题，剩下的就是你的一抗和蛋白量的问题了，再优化吧，
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发表于 2013-8-20 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能有以下原因：
1、上样量过少；
2、marker未必完全可靠，可尝试调整一下转膜条件；
3、一抗、二抗浓度过低，如果质量没问题的话；
4、一抗、二抗质量有问题。
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发表于 2013-8-20 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们之前做也发现这种情况，内参的对照出现很重要，如果内参对照都没出现，显影定影问题也要考虑，我们那次后来发现居然是显影液的问题，并不是抗体的问题，现在市场上有一种可显影的marker，也可以尝试一下，至少可以证明操作没有问题，可以排除一部分因素。
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发表于 2013-8-20 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们有人以前遇到过这种问题，当时是二抗加错了，本来是HRP标记的二抗，结果加成了FITC的二抗。

milipore的显影液很好，这个一般不会出现问题。
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