小中大序列应该是5‘UTR+ATG+Flag+目的基因的CDS+3’UTE, Flag应该是和目的基因5‘融合表达。CDS里的ATG需删除。
如果嫌载体启动子太强,再构建载体是需将其除去。
===========================================================================================================
Flag为什么必须加在5‘端?我觉得应该是两端都可以吧,我没有做过flag,不过我印象中大部分的tag都是可以两端的,我查了下wiki,
cuturl('http://en.wikipedia.org/wiki/FLAG-tag')
上面说“It can be fused to the C-terminus or the N-terminus of a protein. Some commercially available antibodies (e.g., M1/4E11) recognize the epitope only when it is present at the N-terminal.”
所以是不是因为后一句,有些抗体只能识别N端所以才加在5’端?不过应该也有能识别C端的吧?
而且,楼主应该是换表达系统了,所以载体、宿主等等可能都换了,也许tag也可以换了呢,呵呵,供参考哈