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标题:【求助】超声破碎之前是否应加溶菌酶

plaa[使用道具]
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【求助】超声破碎之前是否应加溶菌酶


BL21(DE3)诱导表达后的,超声破碎之后,高速离心分别取上清,以及沉淀重悬液跑SDS-page,结果上清中的蛋白含量很少,但是沉淀中很多。出现这样的情况是不是因为我的菌体很多没有破碎完全,所以沉淀中目的蛋白量比较多,这影响判断包涵体表达吗?是不是在超声之前加点溶菌酶会排除这样的误差干扰?加溶菌酶有没有什么不利的因素?感谢各位指导
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youyou99[使用道具]
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不需要加溶菌酶,超声完全,以溶液不再象泥沙样浑浊为标准,溶液变澄清,沉淀中较多,说明蛋白以包涵体形势存在。
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plaa[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 youyou99 于 2013-8-20 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不需要加溶菌酶,超声完全,以溶液不再象泥沙样浑浊为标准,溶液变澄清,沉淀中较多,说明蛋白以包涵体形势存在。

首先感谢阁下的关注。您说的标准应该是小样菌体吧,我一般摇1L的菌,大约有6g的湿菌,裂解缓冲液25ml/g重悬沉淀,然后全部拿去超声,从泥沙样浑浊状态到澄清,没实现过,所以也不知道怎么判定是否完全破碎。因为菌体较多,超声时间过长,有些蛋白碳化的现象了,所以一般到“某种”状态,我就不超了。
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建议分成多管再进行超声破碎,这样的话比较彻底,6g湿菌一起超声的话,时间长,产生的热量也多,蛋白也容易降解,同时超声不彻底,不好判断。
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qianqin1977[使用道具]
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如果蛋白很珍贵,那就是用商业化的裂解液,譬如默克/NOVAGEN的bugbuster,针对GST等大标签的可溶性融合蛋白很适用;如果蛋白表达量很高很容易得到,那就超声吧,个人感觉超声到菌液透明的程度很难把握(尤其是菌液量比较大的情况下),毕竟超声功率和超声时间很难优化。
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plaa[使用道具]
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建议分成多管再进行超声破碎,这样的话比较彻底,6g湿菌一起超声的话,时间长,产生的热量也多,蛋白也容易降解,同时超声不彻底,不好判断。

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谢,的确是这样的,分管超可以更容易判断,谢谢
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我摇2L的菌液后大概可以收到7g湿菌体,然后不加溶菌酶直接超声15分钟,感觉效果挺好,过程参照分子克隆。如果你的目的蛋白和溶菌酶相差很大,可以加一下比较破碎效果
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首先感谢阁下的关注。您说的标准应该是小样菌体吧,我一般摇1L的菌,大约有6g的湿菌,裂解缓冲液25ml/g重悬沉淀,然后全部拿去超声,从泥沙样浑浊状态到澄清,没实现过,所以也不知道怎么判定是否完全破碎。因为菌体较多,超声时间过长,有些蛋白碳化的现象了,所以一般到“某种”状态,我就不超了。

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不要说6g菌,选择好超声探头和超声功率,100g菌体,1000ml破菌缓冲液也可以用超声一次来破菌。

“蛋白炭化”应该是不可能的啦。

超声破菌要注意的是降温。冰水浴不可少,破菌液也可预冷。

一般用工作4秒,间隙4秒,超声200次足够了。总时间大约25min。

对破菌来说,没有必要去判定是否完全破碎。因为你要的是重组蛋白,而不是破菌率。即使有部分菌体没有破碎又有何妨呢。
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c86v[使用道具]
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可以采用先加溶菌酶破壁,然后放在磁力搅拌器上搅拌,大约30min变成粘稠状即可,然后超生,常规功率,超3s,歇3s,就可以离心了,菌体一般摇个200-300ml。
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plaa[使用道具]
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不要说6g菌,选择好超声探头和超声功率,100g菌体,1000ml破菌缓冲液也可以用超声一次来破菌。

“蛋白炭化”应该是不可能的啦。

超声破菌要注意的是降温。冰水浴不可少,破菌液也可预冷。

一般用工作4秒,间隙4秒,超声200次足够了。总时间大约25min。

对破菌来说,没有必要去判定是否完全破碎。因为你要的是重组蛋白,而不是破菌率。即使有部分菌体没有破碎又有何妨呢。

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可否指导下超声探头和功率有什么需要注意到事项吗?谢谢
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