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标题:【讨论帖】WB实验真磨人

caihong[使用道具]
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发表于 2013-8-20 18:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】WB实验真磨人

大家好！我是WB菜鸟，实验过程中发现问题一大堆，且听我慢慢道来。目的蛋白是127Kda，内参蛋白是37Kda,我用的是BIO-RAD Mini-Protean II Electrophoresis Cell 系统，直接买BIO-RAD的胶，根据说明书，跑电泳时用的条件是200V，电流60mA,1小时左右，转膜条件是100V，电流350mA, 1小时，但由于我用的机器的电流最大只能提供300mA,所以我就调的是100V，300mA，1小时，但奇怪了，转膜完了发现膜上面和胶上面的预染的MARKER都没有了（三明治顺序没有问题），难道转过了？唯一的一次转膜成功了，曝光后发现只有目的蛋白条带，内参没出来，去哪里了呢？还有，转膜后胶和膜总是融为一体，怎么剥都剥不下来，我都是一小块一小块的弄下来的，那个折腾呀！又是为什么呢？欢迎各位蛋白高手出手相助，先谢谢了！
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9900[使用道具]
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发表于 2013-8-20 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这可能是新手必经的过程吧

提到的问题可能都是操作的细节问题，建议到WB经验丰富的实验室观摩下吧
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发表于 2013-8-20 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉转移的电压太高了吧，我记不得啦，好久没做过实验了，反正第一感觉是电流300mA电压没有那么高，难道是我记错了？还有你的内参太小了吧，目的蛋白127KD，内参会不会跑出去咯。至于胶波不下来，你是说和滤纸粘在一起了吗，以前偶尔遇到过，忘记是啥条件导致的了。要进被窝啦，好冷，改天想起来再补充。。。
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caihong[使用道具]
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发表于 2013-8-20 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上2位的回复。胶和NC膜粘在一块，怎么也剥不下来，好像融化了似的
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-8-20 18:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的电流太大，你可以把电流减小点 把转的时间加长点。
在一个在电转的时候弄个冰块降温。
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caihong[使用道具]
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发表于 2013-8-20 18:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的。目的条带127，内参37，差别这么大，该用什么条件转膜呢？
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发表于 2013-8-20 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是新手，也出现一样的问题，转膜后，胶上没mark，膜上只有很浅的蓝色痕迹
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2013-8-20 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电流太大，导致胶融化，
使用0.22的膜，电泳缓冲液加入少量的SDS，
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2013-8-20 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以先做内参，这样一可以检验你的蛋白量，再者可以由于内参容易出结果你可以根据做内参的条件来控制目的蛋白的条件。还有目的和内参分子量差异大你做胶就要不一样，因为不知道你的操作就随便给你给你讲了下。你要是有兴趣 谷歌生物： cuturl('http://www.servicebio.cn')
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随时欢迎你来参观指导！
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发表于 2013-8-20 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胶剥不下来，怀疑你的转膜缓冲液重复使用次数太多导致，使用的什么牌子的电泳仪呢，转膜条件应该还可以的
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