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标题:【经验】HPLC分析样品的原则

kflsjjfdl[使用道具]
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发表于 2010-3-16 13:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【经验】HPLC分析样品的原则

　根据我多年的分析经验来谈一下我个人的看法：

　　分析一个样品，不是一拿来就试着用各种流动相来分离，而是首先要分析样品着手。是否为高分子化合物、粘度大、具有生物活性的生物分子、有些或全部的样品成分是否可电离(根据这样条件可选择色谱柱、流动相、柱温、流速、离子对试剂、是否需要预处理等等)......

　　具体分析：首先应了解样品的溶解性质，判断样品分子量的大小以及可能存在的分子结构及分析特性，最后再选择HPLC的分离模式，以完成对样品的分析。

　　样品的溶解度，由样品在有机溶剂中溶解度的大小，初步判断样品是非极性化合物还是极性化合物，若样品溶于非极性溶剂，表明样品为非极性化合物，通常可以选吸附色谱法或正相分配色谱法、正相健合色谱法进行分析。苦样品溶于极性溶剂或相混溶的极性溶剂，表明样品为极性化合物，通常选用反相分配色谱法或更为广泛应用的反相键合相色谱法进行分析。若样品溶于水相，可首先检查水溶液的pH值，若呈中性为非离子型组分，常可用反相(或正相)键合相色谱法进行分析。若pH 呈弱酸性，可采用抑制样品电离的方法，在流动相中加入硫酸、磷酸调节pH=2～3，再用反相键合相色谱法进行分析。若pH呈弱碱性，则可向流动相中加入阳离子型反离子，再用离子对色谱法进行分析。若pH呈强酸性或强碱性，则可用离子色谱法进行分析。由于除去固定相中的离子对试剂较慢，当改变流动相时，有时需要长时间的平衡;再由于离子对试剂纯度问题，使离子对中的基线波动问题和干扰问题现象比较常见。

　　优化条件在于最终色谱图中能产生出最嗌分开的谱峰。了解化合物的化学结构，知道是否存在酸或碱，当流动相的pH值=混合物的平均pKa值或接近时,可能会使分离较好。先优化K;随着容量因子的增加，谱峰会展宽，峰形变矮。(当所有谱峰符合1<20的范围时，其流动相已接近最佳了;再Α(≥1.05);最后优化N，不同微粒的柱子均有一个最佳流速，流速再高会降低N值;如果降低流速，则会增加工作时间，但分离度会更好。当流动相粘度增加时，N值也将降低;因此尽可能使用低粘度的溶剂。用最小RS法，另加常识(数一下峰!)，在大多数情况下将是最佳方案。< p>
　　至于谱峰拖尾影响因素是很多的，可解决的办法有：

　　在缓冲不好或离子强度过低的分离中，也会出现保留值重现性差和峰拖尾。增加缓冲浓度(与样品大小相匹配)能大大改善此情况。

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  • miracle   2010-3-16 15:11  可用分  +5   感谢您的无私奉献！
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饮食男女[使用道具]
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发表于 2010-3-16 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢，学了不少。
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amelican_beauty[使用道具]
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发表于 2010-3-16 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不错的经验，楼上真是高人。。
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发表于 2010-3-16 13:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢共享，学习之
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健康千万家[使用道具]
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发表于 2010-3-16 13:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，看来楼主经验丰富啊，建议多多分享！
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发表于 2010-3-16 14:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
知识长了不少。
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发表于 2010-3-16 14:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢，感谢！！！
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maomi520[使用道具]
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发表于 2010-3-16 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢分享，看一下！
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bgwaste[使用道具]
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发表于 2010-3-16 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
小 中 大 非常感谢，学了不少。
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发表于 2010-3-16 20:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
:) :)
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