小中大3.3 系统适用性、检出限和线性关系
取配制的恩替卡韦与异构体的混合溶液，连续进样5次，记录峰面积，得恩替卡韦峰面积RSD为2.3%，光学异构体RSD为3.1%; 分离度为4.3; 恩替卡韦的保留时间约为21～23 min; 光学异构体的保留时间约为30～33 min。理论板数按恩替卡韦峰计>2200，色谱图见图3。
取混合溶液(恩替卡韦及其光学异构体各约20 mg/L)，用混合稀释液逐步稀释，测得恩替卡韦及其光学异构体的检出限均为0.12 mg/L(S/N=3)。
外标法：精确移取适量异构体对照液至10 mL容量瓶中，用混合稀释液定容，制成异构体浓度分别为4.08, 2.04, 1.02, 0.51和0.255 mg/L的系列溶液进样。标准加入法：精确移取异构体对照液4, 2, 1, 0.5和0.25 mL，分别置于10 mL容量瓶中，每份加入恩替卡韦储备液2.00 mL，用混合稀释液定容，所得系列溶液中恩替卡韦浓度为100 mg/L，光学异构体浓度分别为4.08, 2.04,图3 恩替卡韦及其光学异构体的色谱图
A. 恩替卡韦和光学异构体的混合溶液(mixture of entecavir and optical isomer);B. 光学异构体(optical isomer); C. 恩替卡韦(entecavir)。 1.02, 0.51和0.255 mg/L，进样，记录色谱图。以浓度(X)对峰面积(Y)作线性回归，外标法回归方程为Y=27206X-2387.3， r=0.9992;标准加入法回归方程为Y=27005X+58.287，r=0.9998。光学异构体在0.25～4 mg/L浓度范围内有良好的线性关系。由曲线的斜率可知，两条标准曲线几乎平行，说明恩替卡韦的存在对微量光学异构体的测定影响不大。
3.4 稳定性实验、 精密度与相对保留时间
取恩替卡韦(100 mg/L)和光学异构体(1.0 mg/L)混合液，于0, 15和25 h进样测定，观察光学异构体峰面积变化情况。结果测得峰面积RSD为2.1%，表明测定溶液室温放置25 h稳定。
取适量恩替卡韦储备液9份，分别加入不同量的光学异构体溶液，用混合稀释液稀释，制成恩替卡韦浓度各为100 mg/L，含光学异构体高、中、低浓度分别为2.0, 1.0和0.5 mg/L的测定液，每个浓度平行3份，每份重复进样2次，取平均峰面积计算。同法于不同天操作，计算日间精密度。测得日内精密度RSD<1.5%，日间精密度RSD<4.0%(n=3)。
光学异构体的相对保留时间(tR1)以恩替卡韦峰的保留时间(tR2)为参比，计算光学异构体的相对保留值(r= tR1/tR2)。光学异构体相对于恩替卡韦的保留值为1.429±0.004，RSD<1.0%。
3.5 光学异构体的浓度校正因子
准确称取适量恩替卡韦和光学异构体，分别加乙醇溶解、定容，制成储备液。准确量取各储备液适量，加混合稀释液稀释成浓度各为20 mg/L的混合溶液。再逐步稀释成4, 2, 1, 0.5和0.25 mg/L，进样，记录色谱图。根据不同浓度下恩替卡韦和光学异构体所得色谱峰面积，按下列公式计算光学异构体的浓度校正因子(F)。测得该光学异构体的浓度校正因子F=1.10±0.04，RSD=3.96%。F=(A样/A异)·(C异/C样)3.6 回收率实验
按日内精密度测定项下方法配制溶液，根据测得浓度和理论浓度分别计算标准加入法和外标法回收率，结果见表3，获得满意的回收率。表3 光学异构体的回收率实验
3.7 恩替卡韦原料药中光学异构体杂质的检查
取适量恩替卡韦，加乙醇制成0.5 g/L储备液，取该溶液适量，用混合稀释液稀释5倍作为供试品溶液。取供试品溶液适量，用混合稀释液稀释100倍作为自身对照溶液。取对照溶液20 μL进样，调节仪器灵敏度，使主成分峰高为满量程的10%左右;再精密量取供试品溶液和对照溶液各20 μL，进样，记录色谱图至40 min。如果在相对恩替卡韦峰保留时间(1.43±5)%处出现色谱峰，峰面积乘上1.10后与自身对照溶液比较，不得大于对照溶液主成分峰面积 (<1%)。结果3批样品均未检出光学异构体杂质。
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