【求助】测序正确，但是蛋白不表达

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标题:【求助】测序正确，但是蛋白不表达

avi317[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在pET28a载体上连了一段300bp的序列，转入BL21（DE3）中，测序结果正确，我用1mM IPTG，37度诱导5个小时，吸了40微升菌液和10微升上样buffer一起煮5分钟，电泳结果没有看见目的蛋白的条带，目的蛋白理论大小为13000。我又从别的实验室要了BL21（DE3）和pET28a，重新连接转化还是不表达，请各位高手帮忙分析原因，出谋划策，谢谢！

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般来说没有原因。

换载体可能是最快捷的方案。

换表达系统是最后要尝试的方案。

66+77[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不表达原因很多，诱导条件，温度，对宿主细胞的毒性，偏好性，还有很多说不清楚的原因。做表达好比买彩票，有一定的几率，要尝试各种条件。你只买了一张，没中也很正常。

131415[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上的两位版主说的很有道理，蛋白质研究之所以困难就是因为每一个蛋白的情况都不同。建议你让身边的蛋白质研究高手先看看你的设计和测序结果有没有问题，如果没有的话可以先简单的尝试优化条件（多挑几个克隆、更换不同的培养基、改变诱导试剂、尝试不同的诱导剂浓度等等），如果最终还是没有表达的话就更换载体吧。

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

关于稀有密码子什么的就不说了，估计大家都知道。还有比较重要的是mRNA的二级结构，如果转录出的mRNA在N端有较大的发夹结构，而且能量超过一定值（具体多少一时想不起来），也是很难翻译的。
既然已经构建出来了，先尝试各种诱导表达条件比较重要。诱导的OD值，温度，IPTG浓度都要试。我们实验室曾经碰到过需要OD在1.5以上诱导才表达的。还有你只是用菌液去跑电泳，也不是特别精确。有时候你的蛋白表达量低，可能需要培养几百ml，然后纯化后，再去跑电泳才能看到条带。

qhyu[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能你把楼上的这几位说的方法都试过了，还是不能表达。
我就遭遇过了。
哎，惨不忍睹啊。
连全基因合成都用了啊……
每想及此，焦灼不堪！

yes4[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

换载体试试吧

kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

100多个氨基酸的序列，不表达的可能性很小。
诱导条件其实非常宽泛，一般不必细细摸索。
如果没有低级错误的话（12%的胶可能看不见这么小的蛋白），换载体可能会有一定的效果。
找一下同源蛋白的表达条件应该是最快捷的方式了。

qiangren789[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人也有类似经历，测序结果正确就是不表达。建议不要再分析了，直接换载体。

yonger[使用道具]
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发表于 2013-8-27 11:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，都是同道中人啊，大家说的对极了，换载体才是最实在的，不过换之前最好测一下空载体是否好用，就是只诱导空载体表达一下标签，有了再插入目的序列

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