【求助】WB总不出结果啊，真愁死了

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标题:【求助】WB总不出结果啊，真愁死了

冰儿0109[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

WB 一直出不来条带，帮我支支招吧。
我得实验条件是：
转22kd的蛋白.
12%的分离胶，85V过浓缩胶，135V过分离胶.
0.2 NC膜，300mA转1h。

用两只不同的相同分子量的抗体都不出条带，怀疑是没有转到膜上，那我转膜条件怎么改变一下比较好呢？

zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

要怀疑没转上的话，最好电泳时点个预染的Marker，如果转完没有Marker条带就要改变转膜条件了

30moonriver[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

内参能杂出来吗？如果内参杂出来没有问题，那就说明转膜至少部分成功。

DDD[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、转膜时间过长，22kd不需要1个小时就能转上。
2、缓冲液粒sds过多。
3、缓冲液甲醇过少

uaubc[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做过21kd的做出过，刚开始也是做不出，后来就做出来了。我觉得可能你本身蛋白表达丰度低，分离胶用15%，转膜1个小时没问题的，100v，当然也与你用的抗体品牌有关，有的要求上样量高低有关。

冰儿0109[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 zhenxin 于 2013-8-27 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

要怀疑没转上的话，最好电泳时点个预染的Marker，如果转完没有Marker条带就要改变转膜条件了

每次marker都转的很清楚

冰儿0109[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 30moonriver 于 2013-8-27 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

内参能杂出来吗？如果内参杂出来没有问题，那就说明转膜至少部分成功。

内参没有到货呢

冰儿0109[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 DDD 于 2013-8-27 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、转膜时间过长，22kd不需要1个小时就能转上。
2、缓冲液粒sds过多。
3、缓冲液甲醇过少

那我重新配一批buffer吧，不过用这批buffer跑别的kd的条带出来了，就是这个小分子量的不出来，我们实验室公用电泳试剂。

u234[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我经常转22kd的蛋白，我觉得你的问题是转膜时间过长，我分离胶10%，转膜35min。

冰儿0109[使用道具]
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发表于 2013-8-27 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 u234 于 2013-8-27 17:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我经常转22kd的蛋白，我觉得你的问题是转膜时间过长，我分离胶10%，转膜35min。

我试试。
我转过1h，2h，3h。发现1h的时候考马斯亮蓝染色胶发现很多蛋白，觉得蛋白没有转膜过去，2h就转的很干净了，但是可能也转过去了。我试试35min，再试试吧。

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