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标题:【求助】内参可以做出来，目的蛋白总是白板

cbou876[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】内参可以做出来，目的蛋白总是白板


我做了很多次了，内参可以做出来，但是目的总是白板。一抗是新买的，免疫组化可以做出来。那位高手可不可以指点一下，是什么原因呀？谢谢。
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小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做出免疫组化也不能保证抗体好的，很可能是假阳性的，能否说明下抗体的名称和产商，大家好帮你分析，估计原因抗体不好，如果你确定你的实验操作没有问题的话
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luoliqiong[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇到过这种情况，请高手指点下。
抗体有可能有问题，目的蛋白确定转到膜上了吗？
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小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做免疫组化和WB是两个不同的实验，原因有

1.抗体质量是好的：

抗体可能只能用于IHC，不能识别变性的WB中抗原

2.抗体质量是不好的

做出来的IHC是假阳性，一试WB就露馅了，不能用啊

3.抗体质量是好的

能够做出来WB和ihc，是研究者实验设计和样品的问题咯
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qqq111[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在确定抗体无误的前提下，一抗杂交的时间以及浓度也很重要，如果目标蛋白表达比较低的话，再摸摸条件吧。
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目的蛋白含量太低。
或者没有提取到目的抗原。
抗体质量不好。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
胃癌
我是做检测14-3-3蛋白两个亚型θ和ζ在胃癌组织和非胃癌组织中表达，看是否有差异趋势。现在14-3-3蛋白亚型θ在胃癌组织和非胃癌组织中表达已做出来。现在内参做出很明显，但目的14-3-3蛋白亚型ζ后来做出，但条带很淡很淡，看趋势根本就看不出来。一抗是santa crunz 公司的，兔抗人的，一抗稀释1：50——1:500，我现在是用到最高浓度1:50 才做出很淡很淡的条带，以前用1:100什么都没有。蛋白是从组织中提取的，今年7月份提的。问题到底在哪啊？希望你们能帮帮我
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗质量看看有没有问题 适合做组化的未必适合做WB
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

WB 用的抗体是测线性表位，IHC用的抗体测得是空间表位。
要看抗体说明书上适合的试验是哪个哦。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-8-30 13:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人也曾遇到过类似问题，内参做出来很好，抗体也没问题，目的蛋白就是做不出来，结果用免疫沉淀富集目的蛋白后再SDS-PAGE，结果目的蛋白出来了，而且各组差异很明显，这也反证了是样品中的目的蛋白过少而做不出的原因。
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