小中大【讨论帖】蛋白新纯化思路探讨
蛋白新纯化思路探讨
思路:得到需要纯化的样品中所有杂蛋白的抗体,将这些抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上,然后再将需要纯化的样品过这个柱子,所有杂蛋白都结合在柱子上,目的蛋白穿透出来。
具体例子:原核表达蛋白纯化
1. 无目的基因的PET28a-BL21,菌体超声破碎后离心分上清和沉淀,将上清拿去免疫兔子,得到针对杂蛋白的抗体,将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上,命名这根柱子为X。PET28a-目的蛋白1-BL21诱导表达后,菌体超声破碎后离心分上清和沉淀,将上清过X柱,所有杂蛋白跟相应抗体结合,目的蛋白1穿透出来,实现纯化。
2. 无目的基因的PET28a-BL21,菌体超声破碎后离心分上清和沉淀,将沉淀拿去免疫兔子,得到针对杂蛋白的抗体,将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上,命名这根柱子为Y。PET28a-目的蛋白2-BL21诱导表达后,菌体超声破碎后离心分上清和沉淀,沉淀用尿素溶解,复性后过Y柱,所有杂蛋白跟相应抗体结合,目的蛋白2穿透出来,实现纯化。
问题肯定会有很多,我们课题组想尝试这样做一些,请大家给点建议,有哪些需要注意的地方,谢谢。