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标题:【求助】请教各位作DiGE前辈

12xunmei[使用道具]
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发表于 2013-8-31 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教各位作DiGE前辈


小弟刚刚涉入蛋白质组学，在2D电泳的选择上存有疑惑，不知道该选择经典2D还是DiGE。
课题想对不同毒力的病毒感染后差异蛋白进行蛋白质组学分析。
设立三个组（高致病组、低致病组和对照组），主要检测四个脏器的变化，总共21只试验动物。
如果选择经典2D需要（每个样本重复3次）
21只×3个重复×4个脏器＝252块胶
如果选择DiGE需要（每两个样本跑一块胶）
21只×0.5×4个脏器＝42块胶

我的问题是
经典2D电泳与DiGE在价格方面有多大的差异
DiGE是否象传说中的那样神奇，真的不需要重复，DiGE有什么缺点？

希望做过DiGE的前辈不吝赐教！
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发表于 2013-8-31 09:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没做过DIGE，但看过多次DIGE的实验结果，而且也对DIGE的步骤比较清楚，用于DIGE策略的蛋白提取过程中不能添加DTT等物质，部分影响蛋白的分离效果，同时DIGE荧光染色并不像传说中的那么高灵敏度，至于重复性，当然是不错的，不过对于不同的凝胶，虽然DIGE策略中有内标的引入，但对于不同凝胶的比较其实帮助不是非常大，另外，就是关于费用的问题，DIGE的费用一般是1.5万一张（可以得到普通的两张胶的图片），普通双向一般是2000一张，至于生物学重复，做DIGE并不能替代生物学重复，只是可以不进行技术重复而已，而做普通的双向，一般生物学重复也都是一定要的，但是技术重复看个人，有人做，也有人不做，个人感觉只要普通双向技术过关的话，技术重复不做也无所谓。如果严格按照DIGE的标准进行你的实验的话，光实验费就是一个惊人的数字，有这多钱，我估计都可以把图谱上所有蛋白（不管有差异还是无差异）都鉴定一遍了，呵呵！最后给的建议是：如果时间充裕、经费充足、样品量足够的话，找几家公司做一下普通的双向，采用最大的24cm的胶条，考染，在重复性上、质谱兼容性上和检测灵敏度上也都可以获得一个不错的结果。
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发表于 2013-8-31 09:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人觉得做DIGE的主要就是三种情况，自己的设备、少量的样品、钱多得没处花，呵呵！
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发表于 2013-8-31 09:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现在实验室有普通双向的仪器，买套低荧光玻璃板就能上DiGE，至于扫描仪和分析软件可以到其他实验室借用。

因为有仪器，所以电泳方面要自己做，后期挖点，质谱可以找公司。

如果作普通双向84个样本工作量是不是太大了？
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-8-31 09:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
光有板还不行啊，还要染料，这可是超贵的东西
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发表于 2013-8-31 09:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

被我说中了，呵呵，果然是自己有仪器的，如果你们自己操作DIGE的技术体系比较成熟的话，可以考虑用DIGE，不过做这么多张胶的荧光染料，荧光染料的费用也还需要花点钱，另外，关于你的实验，21只实验动物并不是一定需要分别跑胶的，可以分成3组，每组7只的样品混合成一个样品进行电泳实验，这样工作量就大大减少了，如果是我做的话，凝胶数如下：
普通电泳：3组样品*3组处理*4个器官=36张普通凝胶
DIGE（用对照组样品取代内标）：3组样品*3组处理（在一张胶上同时进行）*4个器官=12张DIGE凝胶
这样设计的话，凝胶数目就少很多了，而且也很有代表性，发文章的话一般也不会出什么问题。
期望我的设计对你有用！呵呵！
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发表于 2013-8-31 09:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一张DIGE胶所需的染料费和其它费用大概是2000左右，12张也就3万，可以承受，而且你通过这次实验可以把你们的DIGE平台建立起来，对于以后的实验都大有好处
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发表于 2013-8-31 09:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

要想做好DIGE，必须先做好2D，直接做DIGE，只会费钱！而且还做不好
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发表于 2013-8-31 09:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我说中了，呵呵，果然是自己有仪器的，如果你们自己操作DIGE的技术体系比较成熟的话，可以考虑用DIGE，不过做这么多张胶的荧光染料，荧光染料的费用也还需要花点钱，另外，关于你的实验，21只实验动物并不是一定需要分别跑胶的，可以分成3组，每组7只的样品混合成一个样品进行电泳实验，这样工作量就大大减少了，如果是我做的话，凝胶数如下：
普通电泳：3组样品*3组处理*4个器官=36张普通凝胶
DIGE（用对照组样品取代内标）：3组样品*3组处理（在一张胶上同时进行）*4个器官=12张DIGE凝胶
这样设计的话，凝胶数目就少很多了，而且也很有代表性，发文章的话一般也不会出什么问题。
期望我的设计对你有用！呵呵！

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谢谢前辈的指点，将7个样品混成一个样品进行电泳可以吗？有这方面的文章可以参考吗？如果有那真是太好了。我可以减少2/3的工作量。另外，还想请教一下前辈，普通电泳要求三次技术重复，你的试验方案中没有技术重复，如果发文章的话，可以通过吗？
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 小中大
要想做好DIGE，必须先做好2D，直接做DIGE，只会费钱！而且还做不好

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谢谢你的指点，现在我正在摸索普通2D的条件。
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