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标题:【求助】蛋白表达与预期结果不同

079777chao[使用道具]
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发表于 2013-8-31 10:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达与预期结果不同


各位高手，我在表达一种蛋白，SDS-PAGE跑胶显示大小比预期大将近10KD，我的序列1164bp，用的是KG载体。我用蛋白质分子量计算器算过1164bp大概表达的蛋白质为42KD，加上GST标签27KD。大约为69KD，可我的跑胶结果大约在80KD左右，请问这是什么原因？我的重组质粒测序结果、酶切结果都是正确的。谢谢各位高手！希望大家不吝赐教！
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2013-8-31 10:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实稍微有点差异是很正常的事情，你可以做个WESTERN，如果能反应的话就算是了。有时候PCR扩的时候会多扩或少扩一点的。。。。。。不好意思
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yes4[使用道具]
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发表于 2013-8-31 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该问题不大吧，用这个计算器计算结果可能不是很精确，蛋白质marker也没有那么精确，特别是在大分子量的位置比较不准，所以只要你的蛋白大致在差不多的位置就可以了。当然非要检测对不对的话，真的只能是western了，GST的抗体比较常见，可以试一下。祝好运 。
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发表于 2013-8-31 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yes4 于 2013-8-31 10:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

应该问题不大吧，用这个计算器计算结果可能不是很精确，蛋白质marker也没有那么精确，特别是在大分子量的位置比较不准，所以只要你的蛋白大致在差不多的位置就可以了。当然非要检测对不对的话，真的只能是western了，GST的抗体 ...

你好！谢谢你的回答！我的蛋白将来要用来做单抗，所以想将复性后的包涵体蛋白的GST标签切掉，请问有什么方法吗？谢谢！
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发表于 2013-8-31 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 shenkunjie 于 2013-8-31 10:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

其实稍微有点差异是很正常的事情，你可以做个WESTERN，如果能反应的话就算是了。有时候PCR扩的时候会多扩或少扩一点的。。。。。。不好意思

嗯 好像是这样的，只能通过western来检测了。我想在western之前纯化一下蛋白，而且这个蛋白将来要用做单抗制备，请问有什么好的方法吗？我想把GST标签切掉，这个我还不知道该怎么做。谢谢！
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发表于 2013-8-31 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！谢谢你的回答！我的蛋白将来要用来做单抗，所以想将复性后的包涵体蛋白的GST标签切掉，请问有什么方法吗？谢谢！

==============================================================

1、做单抗不一定要将GST标签切掉。只要后期的单抗细胞株筛选把好关就可以的。

2、切去GST标签要根据你构建的序列中有没有相应的酶切位点来。
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079777chao[使用道具]
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发表于 2013-8-31 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 memory 于 2013-8-31 10:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好！谢谢你的回答！我的蛋白将来要用来做单抗，所以想将复性后的包涵体蛋白的GST标签切掉，请问有什么方法吗？谢谢！

==============================================================

1、做单抗不一定要将GST标签切掉。只 ...

请问这个酶切位点怎么看？是查一下凝血酶的酶切位点，然后看一下我的序列里是不是有吗？谢谢！
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memory[使用道具]
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发表于 2013-8-31 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 079777chao 于 2013-8-31 10:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


请问这个酶切位点怎么看？是查一下凝血酶的酶切位点，然后看一下我的序列里是不是有吗？谢谢！

如果你用的是商业化的GST标签质粒，那么质粒图谱中应该可以清晰地表明酶切位点的所在，查一下你的目标序列插入位点就知道了。
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079777chao[使用道具]
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发表于 2013-8-31 10:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 memory 于 2013-8-31 10:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


如果你用的是商业化的GST标签质粒，那么质粒图谱中应该可以清晰地表明酶切位点的所在，查一下你的目标序列插入位点就知道了。

我的KG载体是同学给我的，应该是商业化的，可是我在网上找到的图谱只有酶切位点部分的序列 看不到GST标签那一部分，请问您有KG载体的图谱吗？或是在哪里去找？谢谢！
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memory[使用道具]
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 小中大

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