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标题:【求助】western 目的条带未出现，marker却出来了

purrr[使用道具]
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发表于 2013-9-4 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western 目的条带未出现，marker却出来了


我显影后发现胶片上出现了marker的条带，但是目的条带没有出来，整个胶片很干净，除了隐约有mark的条带什么都没有，不知为何？难道一抗都结合到maker上去了？
压片时间：2小时
我的一抗是兔来源的多克隆抗体，cst的买了不到一个月；
二抗是羊抗兔，Santa Cruz的；
marker 是MBI的Prestained Protein Ladder，希望高人给予解答！

另外，我的目的蛋白是膜蛋白，我是用RIPA提的总蛋白。转膜后marker条带很清晰。丽春红染色可以看到杂蛋白条带。内参用的是GAPDH，显影有条带。


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2013-9-4 16:46
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any333[使用道具]
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发表于 2013-9-4 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你加完底物之后就立刻压片吗？如果是这样你的一抗有问题 可能已经不能用了 ，你可以检验一下你的一抗是否能用。

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sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-9-4 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，如果这个WB你之前没做过，是第一次做，那么你的问题出现在转膜上，或者一抗上。
根本就没转上膜，或者根本就转穿了。建议调整转膜时间，并用丽春红预染。
一抗失效或浓度偏低。建议调整一抗。
如果你之前做过，只是这次没做出来，那么建议你，检查条件跟以前是否一致。
这种情况，我可以基本断定问题出现在转膜步骤，而不是一抗二抗。因为大家都知道一抗二抗重要，都比较重视。恰恰忽略了，电泳和转印却是前提。。。
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-9-4 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先确认转膜成功没？每次做完用丽春红染染看看，不要盲目去做，我以前就是老吃这样的亏。然后再看你的一抗、二抗是不是合适，是不是失效了等等。完全同意楼上的建议。
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purrr[使用道具]
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发表于 2013-9-4 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 sunnyB 于 2013-9-4 16:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

首先，如果这个WB你之前没做过，是第一次做，那么你的问题出现在转膜上，或者一抗上。
根本就没转上膜，或者根本就转穿了。建议调整转膜时间，并用丽春红预染。
一抗失效或浓度偏低。建议调整一抗。
如果你之前做过，只是这次没做 ...


可是我用丽春红染色可以看到蛋白条带，并且内参是可以做出来的。marker是预染的，在膜上很清晰。转膜我是40V for 3hours，难道转膜时间长了？我的目的蛋白是50kD 和 80KD的。我是第一次做western，有没有可能是NC膜时间长了失效了？
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-9-4 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜时间与你使用的是什么品牌的转印槽有关系。如果你使用的是BIO-RAD的mini湿转，40V，3h这个条件我认为不合适。当然，你一定要参照你们实验室之前的实验条件。
50KD和80KD这个分子量的蛋白，应该属于大分子量范围。
我推荐如下：
1.将转印条件改为100V，120min（针对bio-rad mini湿转）
2.检查上样量，总蛋白控制在10ug。不要过大。
3.根据你的Marker出条带，二抗应该问题不大。检查一抗是否失效，是否稀释妥当。
4.曝光时间做梯度，3min为基准。如果Marker还像上边那张图一样不清晰，则增加时间。反之减少曝光时间，直至3-5s。
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-9-4 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看你提取的方法是否正确，我之前用RIPA提取的也是没有做出来，一般膜上蛋白不好提，所以我用专门的膜蛋白提取液做出来了！我不知道你机子什么型号，我也觉得转的时间太长了，你可以咨询一下厂家，或者你放两张膜，然后用丽春红染一下，看第二张膜上有没有蛋白条带，还有你蛋白上样量多大？太大的话很容易淬灭，所以减小上样量看看！还有你用的ECL是什么的？你一抗浓度是不是太高了，还有二抗？
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sunnyB[使用道具]
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 小中大

根本不存在萃灭的可能，我试过萃灭是什么样的：中间某一区域是透明的，周围是黑色一片。你可以看他的底片，怎么可能是萃灭，那完全是什么东西都没有嘛。
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purrr[使用道具]
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 小中大
我换了进口的ECL（Thermo）做了一次，一抗浓度提高一倍1：500，二抗1：5000，压片30min，中间各别泳道隐约出现一些非特异条带，marker条带没有了，目的条带还是没有。

谢谢各位战友的指点，我会继续摸索条件，（例如改变转膜条件）另外我怀疑蛋白有降解，我刚订购了一盒蛋白酶抑制剂cocktail，这两天培养箱故障，得过一段时间才能养细胞提蛋白了
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koook5695[使用道具]
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 小中大

你可以试试再重新做一次，转完膜后染胶看看
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