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标题:【讨论帖】Western 及抗体

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发表于 2013-9-5 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】Western 及抗体

我去年做了一两千个western blot 什么事都遇到过了，技术超强，有问题只管问， 但是我的时间有限， 问问题最好能具体点，我才好回答。请尽量用帖子发，这样会有更多人受益！

sean

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发表于 2013-9-5 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

就我的经验看，就整个Western Blot来说， 我觉得最关键的步骤在前面，1.制样 2.电泳 3.转移 4. Block，
其中1和3更为重要， 后面的步骤按照标准来就行了， 最多有一些小调整。 你们在实际应用中有问题可问， 越具体越好。我尽量解
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发表于 2013-9-5 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
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发表于 2013-9-5 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western blot 则上样量要均等， 如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行 了， 但是不要超过（具体的数值我忘了，）
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发表于 2013-9-5 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

you shouldn't loading more than 0.3ug/mm2 for one well.
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发表于 2013-9-5 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗，二抗的比例还是蛮重要的
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发表于 2013-9-5 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xue258 于 2013-9-5 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一抗，二抗的比例还是蛮重要的

对， 调整好一抗，2抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
大家有问题就来问吧！
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发表于 2013-9-5 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
终于有牛人了 ，我准备做western blot ，但听说很难 ，不知你那有没有较好的protocol ，我好依葫芦画瓢
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发表于 2013-9-5 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做WESTERN重复性很差，这一次出结果了，可是再重复做就不出阳性结果了，我反复做了好多次，就是不能每次都重复出来，而且，即使有阳性结果，条带也很浅，请问高人，是何原因？
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发表于 2013-9-5 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教一下，半干转是否要求膜，3m滤纸，胶同样大小？
因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？
什么是短路？如何控制和发现短路呢？谢谢指点
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