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标题:【求助】转膜恒压好还是恒流好？

yychen[使用道具]
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发表于 2013-10-6 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】转膜恒压好还是恒流好？


我前次转膜使用的是恒压，即将电压设为150V,并做好冷却，但是真正转开时候只有105V，转膜2小时结束后电压降为80V，结果是预染MARKER从胶上转到了NC膜上，但是胶经过考染后还可以看到清晰的条带，我想问问各位高人，为什么预染MARKER从胶上转到了NC膜上，而蛋白却转不完全？另外，转膜恒压好还是恒流好？我的目的蛋白是42KD.
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yychen[使用道具]
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发表于 2013-10-6 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

虽然想让它恒压可是电压就是往下掉。
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plaa[使用道具]
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发表于 2013-10-6 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以试一试100mA稳流转移2小时
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-10-6 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先解决你第一个问题，150V恒压转膜但是真正转膜时电压却达不到，那是因为你设置了最大电流值。举个例子，假设你设置最大电流100mA，同时设置150V恒压转膜，可能当105V时电流就达到了100mA，所以电压就上不去了。要解决这个问题，你可以把最大电流值设的再大一些。
第二个问题，事实上，控制最适合的转移条件是比较困难的。不完全转移或过度转移很常见，只要最后抗体孵育后做出结果就可以了。
第三个问题，这是个见仁见智的问题。我们一般用恒压，因为它相对安全一些。转膜过程中，随着滤纸变干、电阻变大，如果恒流的话，那么电压势必增大，可能烧胶；如果恒压的话，只是电流减小一些而已。
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-10-6 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先慢转一个小时，再加大力度２－３个小时．这样的效果最好．
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8s5g[使用道具]
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发表于 2013-10-6 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转 膜：蛋白质经SDS-PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纤维膜即NC膜（AR0135）或PVDF膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，包括湿式电转印和干式电转印。
1）干式电转印： 将转印槽阴极平放工作台上，并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸，将电转印液浸透0.45um的N.C膜放在滤纸上，再将凝胶平放在N.C膜上，最后在凝胶上加盖三层电转印液浸透1mm厚的滤纸，根据凝胶面积按1-2 mA/cm2, 接通电源，经1-1.5小时电转印。
2）湿式电转印： 打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放三块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜、凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，按照 (-) 夹板-海棉-滤纸-胶块-NC膜-滤纸-海绵-夹板 (+)装好,除尽气泡，夹好电转印夹。 电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极, 4℃ 250-300mA, 转印80min。
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发表于 2013-10-6 13:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉楼上的说法不是很准确，我认为电泳仪要么设为恒压，这样电流跟着电压变，要么设为恒流，这样电压跟着电流变，可以同时设定两个值的么？当然这个电压或电流值不是无限制的大，bio-rad的仪器有默认的最高电流500mA。另外，湿转的时候滤纸不是泡在缓冲液里的么，不会变干吧？当然随着离子的减少，电压升高是可能的。
我我觉得是不是三明治没有夹紧啊？可以多垫一些滤纸，夹好，100V 1.5-2h就可以了。
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xue258[使用道具]
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发表于 2013-10-6 13:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

湿式电转印： 打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放三块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜、凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，按照 (-) 夹板-海棉-滤纸-胶块-NC膜-滤纸-海绵-夹板 (+)装好,除尽气泡，夹好电转印夹。 电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极, 4℃ 250-300mA, 转印80min。
我的蛋白就是40kDa左右，用了280mA，转印80min，效果很好，屡试不爽。你试试吧
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发表于 2013-10-6 13:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的回答比较全面了,而且不与楼上的楼上的解释矛盾,因为他说的是半干转
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发表于 2013-10-6 13:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一直也想问同样的问题，综上所述，半干转是恒压好了，那湿转呢？

今天还发现一个奇怪的现象，事先设了100v，2h后去看，只有63v了，是湿转，biorad的，以为自己设错了，再试，结果设了100v，又跳回A了，400mA，还是60v左右，不知咋回事？哪位指点一二吧？
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