【求助】求助western高人，荧光淬灭都快把我逼疯了

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标题:【求助】求助western高人，荧光淬灭都快把我逼疯了

qqshepherd[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于western显色荧光淬灭的解释都是蛋白浓度、一抗或者二抗浓度过高的缘故。我也曾试过我二抗浓度降到推荐的最低，可是还是不行。下面我把我的具体情况给大家说一下，希望同仁们多多帮助，不吝赐教！
我是提取细胞裂解液上样，最初的时候因为要检测的蛋白表达量低所以上样60ug，用的的PIERCE的荧光显色，开始1：2000稀释二抗，显色结果很好，荧光也非常亮，非常持久，stripping 3次以后还是能得到持久的荧光显色。但是不知道从什么时候开始，莫明的就出现了荧光很快淬灭的现象。就是加上显色底物以后，荧光就迟也在2分钟内消失。我在版上和PIERCE的说明书上仔细的学习过了，都是说二抗的浓度高，后来我就把二抗降到说明书推荐的1：5000,在暗室中观察加上显色底物荧光非常暗，但还是会很快消失。后来我又把上样时的蛋白总量减半但还是不能解决问题。
我的问题有这么几个：
1. 以前1：2000的二抗浓度，荧光有量又持久，而现在二抗降的再低都不行，这是为什么呢？
2. 荧光消失以后再补加显色底物，荧光亮一下，消失的更快，而且把底片在膜上一压，荧光就马上淬灭，这又是为什么呢？
3. 我还发现如果一张膜杂一个抗体时淬灭，stripping后杂别的抗体都会淬灭

现在都快疯了，和以前做实验的步骤方法都没有差别，但现在一曝光就淬灭，恳求大家帮帮忙啊！！

u76mp[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

荧光的快速淬灭应该不是你上样量和二抗的问题。
很多国产二抗效价根本达不到1：5000的。此外，如果60 ug的上样量，ECL就出问题了，我想PIERCE的质量也太差了。

因为没用过PIERCE的ECL试剂盒，所以只能根据我的经验来猜测几种可能：

1. ECL试剂盒应该有A液和B液。A液是发光物，B液是0.1％的过氧化氢。所以，你回忆一下，在取A液和B液的时候会不会忘了换枪头，导致AB液之间有污染，容易造成ECL效果减弱。
2. A液要严格低温避光保存，会不会在亮光的房间里打开过A液。
3. 仔细检查你用到的缓冲液，如TBST或者STRIPPING buffer，看看PH是不是有明显改变。

good luck
如果找到原因了，也请发上来，或许对其他人会有帮助

qqshepherd[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 u76mp 于 2013-10-6 15:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

荧光的快速淬灭应该不是你上样量和二抗的问题。
很多国产二抗效价根本达不到1：5000的。此外，如果60 ug的上样量，ECL就出问题了，我想PIERCE的质量也太差了。

因为没用过PIERCE的ECL试剂盒，所以只能根据我的经验来猜测几种 ...

我们实验室A液和B液都是一起用的，其他人做也没有淬灭啊
我做60ug的蛋白量，开始没有淬灭，后来做得多了，就出现淬灭的现象了

langlang[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你使用的溶液中是否有污染荧光淬灭剂的可能？

kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

淬灭后你曝光X片上有条带吗？我有时候加显色底物后也看不到荧光，压片时间延长也有条带啊

wood533[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是不是你们的暗室比较热？

qqshepherd[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

淬灭后你曝光X片上有条带吗？我有时候加显色底物后也看不到荧光，压片时间延长也有条带啊

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淬灭以后就曝不出带了
以前试过压片时间延长，结果是第一张底片上能有几条没有淬灭完全的条带，在曝第二张的时候就是一片空白了

qqshepherd[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是不是你们的暗室比较热？

===================

请问是温度高淬灭得快吗？

DONT[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问是温度高淬灭得快吗？

======

是的

DONT[使用道具]
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发表于 2013-10-6 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼主发现是什么原因了吗，我也遇到这个问题了，加了AB液后荧光很强，于是先压了20秒，后来又压了1分钟、 30秒的，结果出来居然只有第一次的条带，再看也不见荧光了，是什么原因呢，我一抗用1：250（因为前面1：500没做出来）二抗用1：2000

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