小中大楼主没有说明该蛋白用什么方式纯化，由于表达的蛋白常常是用亲和标签纯化，所以我姑且认为楼主是在做Ni柱亲和层析。以下因素请楼主考虑：
1. 确定这两条蛋白是杂蛋白？是不是你要的蛋白条带？或者蛋白的二聚体，或者转录提前终止或者终止不完全的产物？
你有没有做Western确认你的蛋白就是单一的目的条带？
2. 上样量是不是符合要求？上样量过大，会造成非特异的结合。你考虑一下，是不是需要降低上样量再尝试一下？
3. 在洗涤的时候，为了将杂蛋白除去，是否需要添加更严酷的条件？例如，提高wash buffer中的咪唑浓度？
4. 是否可以增加洗涤次数来除去杂蛋白？
5. 楼主在做层析的时候，是不是将样品溶液、第一次洗涤液、第二次洗涤液、第三次洗涤液、第一次洗脱液、第二次洗脱液、第三次洗脱液分别收集取样，然后做SDS-PAGE?能否贴个图上来看？
因为楼主没有提供足够的信息，所以我也没有更多的建议了。
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呵呵，你说得wash buffer 是不是我所说得蛋白上样前得binding buffer？我用的5mM得咪唑浓度。下次试着把浓度提高看行不行
下面回答你得问题：1给你看的纯化后的胶图36KD上面那两条大的条带不是我的目的条带，至于你说得是不是蛋白二聚体就不清楚了师姐之前做过Western，证明36KD得带是目的带。
2 你说的上样量是纯化时柱子得上样量吗？我摇了200ml培养基，用30ml缓冲液重悬上样得，我做纯化时用的手动得镍亲和层析柱，不是用得纯化仪，所以流速不能自己确定，有时上样快，有时上样慢。
3洗涤得时候用的缓冲液是5mM的binding buffer
4上样完后，我总是会用5mM的binding buffer洗50ml之后才会用洗脱液将蛋白洗脱下来
5我每次纯化都是将各个不同浓度的洗脱液洗下得蛋白分别收集，但每隔浓度洗下的蛋白都有那两条杂带，无语了啊
现在问题差不多说明白了把，哈哈，这个怪我表达能力太差嘿嘿，希望多指点
