【求助】初学者双向电泳图像分析

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标题:【求助】初学者双向电泳图像分析

qqq111[使用道具]
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发表于 2013-10-7 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

敬爱的前辈高手们：
我是个刚接触蛋白质组学不久的小菜鸟！前几天在师兄师姐们的指导帮助下跑了张双向电泳图谱（胶条17cm、PH4-7，二向胶浓度11%，G-250染色）。
图像右边看起来还凑合，可是左边横向成了“彗星”，maker 也不见了一条（不知道是不是因为没染上色，我扫描图像时没见到下边有蓝色横纹！），右边还有蓝色的 “竖带”也不知道是不是胶条PH没选好！。。。。。
总之，请各位前辈高手们帮我分析一下我的电泳图谱，也请大家提出改进建议和意见！谢谢各位高手前辈们了！

附件

2013-10-7 15:38

97256295.snap.jpg (29.98 KB)

qqq111[使用道具]
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发表于 2013-10-7 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

忘了补充一点条件了：
实验材料是石斛兰花芽，酚抽提法，上样量1mg左右
电泳条件如下： 50V 主动水化 12h
250V 线性 1h
1000V 快速 1h
4000V 线性 1h
10000V 线性 5h
10000V 快速 70000Vh
500V 快速 24h
二相使用的是GE的Ettan DALT six系统，上槽2*缓冲液，下槽1*缓冲液，电泳条件如下：
1W 30min
7W 7h

ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2013-10-7 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

水化和升压过程没有什么问题，二相我们通常是设置电流恒定，10ma/30min，25-30ma/5-6h，使电压缓慢上升，这样跑出来的蛋白点比较圆，功率恒定的没有试过效果
我觉得你电泳图的问题跟一向和二向电泳设置关系不大，如果说胶条的右边是7的话，那么右边蓝色的 “竖带”是因为蛋白的等电点超过了7而聚到了最右边，这部分蛋白需要换3-10nl或者3-10线性胶条分离，marker最下面一条跑没影了可能的原因很多，结合你的图上的状况我感觉你的胶可能还没有完全凝好就跑了，再个下次把二向胶浓度提到12.5%试试，而且电泳液记得新配
最大的问题是酸性端的整个模糊，主要原因是样品没有处理好有污染导致聚焦不良，我想知道你酚抽提法的具体步骤以及蛋白上样前是否再经过TCA/丙酮沉淀

yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-10-7 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了上面老师的讨论，学生想请教一个问题，我想做二维电泳的实验，但是因为起初不知道，标本取好以后没有用ＰＢＳ液冲洗，没有去除表面的血液，这样血液中高丰度的蛋白质会在胶上将会掩盖有意的蛋白质点。。。现在标本保存在液氮中，不知道怎样处理才能去除这些血液成分？？？？因为都已经冻在一起了。。。。十分焦急，谢谢帮助。。。

qqq111[使用道具]
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发表于 2013-10-7 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先谢谢您的指点！
再次，再请教您几个问题：
请问我选用PH5-8的胶条可以吗？左边的蛋白没聚焦好，看起来也没什么分布！我灌好二向胶后隔夜放置了9.5h（23：30—9：00），且外用塑膜保水了！二向胶没聚合好是不是还有别的原因呢？再请您指教！电泳液也是隔夜配的，4度保存了大概10小时！12.5%的胶倒没用过呢，这个一定要试试！不过您能告诉我为什么这样做吗？我的技术很不专业、很不过关，还请您多多指点！

这是我的“酚抽提法”的过程：

称取春石斛芽，在预冷的研钵中液氮研磨成粉
↓
加750ul酚抽提液与1000ul水饱和酚混匀
↓
13200rpm 15℃ 离心25min
↓
吸取上层酚相，加入0.1M醋酸铵甲醇①
剩余下层水相，加入1000ulTris饱和酚混匀
↓
13200rpm 15℃ 离心25min
↓
吸取上层酚相，加入0.1M醋酸铵甲醇②
下层水相及杂质等丢弃
①和②-20℃沉淀过夜
↓
13200rpm 15℃ 离心30min
沉淀加入6-8ml的冷丙酮(0.07%β-ME)洗一次
(每次-20℃沉淀20min， 13200rpm 4℃ 离心30min，弃上清)
↓
沉淀加入6-8ml的80%冷丙酮(0.07%β-ME)洗一次
(每次-20℃沉淀20min， 13200rpm 4℃ 离心30min，弃上清
↓
沉淀加入1.5ml的冷丙酮(0.07%β-ME)洗两次
↓
真空干燥，蛋白沉淀-80℃保存

注：
酚抽提液（100ml，4℃保存）
蔗糖 0.7M 23.96g
氯化钾 0.1M 0.746g
EDTA 50mM 1.461g
Tris 0.5M 6.057g
HCl 30mM 0.25ml
双蒸水定容到100ml
ß-巯基乙醇 2%（v/v）现用现加

蛋白上样前没有再经过TCA/丙酮沉淀！这个有什么关系吗？请您指点！
“最大的问题是酸性端的整个模糊，主要原因是样品没有处理好有污染导致聚焦不良”样品那里没处理好呢？这些污染主要是指什么呢？再次请您指点！谢谢您啦！
再次感谢！谢谢！

qqq111[使用道具]
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发表于 2013-10-7 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

marker最下面一条（14.4KD）跑没影了可能不可能是我的胶浓度太低了呢？7h30min时间里它就自己溜达出去了！
再说，对于花芽这种核酸和鳞片较多的材料用什么方法提取蛋白会比较合适呢？
众位前辈高手们，大家帮帮忙吧！谢谢大家了！！鞠躬！！！

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发表于 2013-10-7 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好,大致看了下你的提取过程,我初步怀疑是样品中的酚没有除干净,而且提取液中很多成分均可对聚焦产生污染和横温,第二向聚焦没有什么大问题,提高胶浓度是为了避免小分子量蛋白跑出胶,
不知道为什么要使用酚抽提,和蛋白的性质有关么.....如果条件允许的话试试GE的cleanup提取蛋白,可能效果会好些,祝你成功!

qqq111[使用道具]
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发表于 2013-10-7 15:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在我已经提高了胶浓度！
想再请教您几个问题：
1. 酚抽提蛋白后，酚没除干净？那样该如何改进以便除去酚呢？
2.“提取液中很多成分均可对聚焦产生污染和横温”很多成分是指哪些成分呢？该如何改进呢？
酚抽提法是一篇英文文献上看的，现在已经很普遍在用了!目前觉得与蛋白性质没多大关系，我们实验室摸索用了这种方法半年了，效果还可以！
以前也有师姐用过GE的cleanup提取蛋白，可是做完几乎没有蛋白了，大概GE的cleanup很不适用于我们的实验材料！

众位前辈们请给晚生一点指教吧！谢谢众位前辈了！

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发表于 2013-10-7 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

具体怎么除酚我不知道，因为没有用过这种方法，但我们常用的是ＴＣＡ／丙酮沉淀蛋白，然后用乙醚／乙醇　１；１把ＴＣＡ除掉，否则ＴＣＡ酸性带电荷会导致聚焦不良或短路，而且你提到样品中核酸和羚片比较多，可以适当提高Ｄnase酶的浓度，我们用的是promega的dnase，１ml加１５Ｕ单位，再蛋白上样前适当增加超速离心的步骤，除去不溶物和溶解度不好的蛋白，cleanup针对任何提取都可以，但会损失１／３的蛋白，所以你决定用cleanup需要加大最初的提取量
不知道你跑２Ｄ的目的是什么，如果想获得更好的图片效果我觉得你可以该用５－８的胶条

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发表于 2013-10-7 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是我的技术不过关，也可能是材料的关系，我用TCA/丙酮跑得图和酚抽提法跑的相差甚远！您说得超速离心转速大概是多少呢？我用的是13200rpm的，也是我所能用的离心机最高转速了！
我也在考虑上加入适量的核酸酶，主要是考虑是加Dnase还是Rnase，花芽中含什么酶多一点？除去那种核酸最有必要呢？
我跑２Ｄ是很希望得到更多的蛋白，也想获得较为美观的图谱，后期还要质谱分析的啊！
我也是准备跑下PH5—8的大板看看呢！呵呵！

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