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标题:【求助】请教GST pull down

standbyme[使用道具]
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发表于 2013-10-8 14:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教GST pull down

我最近要做GST pull down，但是不知道该实验需要的GST affinity matrix或者bead在哪里购买，

另外是否用过GST亲和层析柱如GST FF、Glutathione Sepharose 4B做pull down实验？

请大侠不吝赐教，谢谢了
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3648755[使用道具]
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发表于 2013-10-8 14:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用是用过Glutathione Sepharose 4B，但不知道pull down是什么
就是用Glutathione Sepharose 4B亲和结合GST蛋白标记啊
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birdfish[使用道具]
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发表于 2013-10-8 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

包被有GSH的Beads可以在Sigma买到，一般1ml或5ml装，1ml价格大概是200多块钱，注意1ml指的是用水或者TE溶胀后的1ml，买来是粉末的，大概70mg.
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yysr238[使用道具]
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发表于 2013-10-8 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是可以用Glutathione Sepharose 4B做的，我也准备做
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standbyme[使用道具]
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发表于 2013-10-8 14:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我设计实验时曾设想在amersham的FPLC上接GST亲合层析柱来作pull down, 但是发现无法在柱上孵育, 而且现在室温很高, 时间长了只怕东西都臭了

所以还是做了用传统方法来做的心理准备
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standbyme[使用道具]
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发表于 2013-10-8 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的Glutathione Sepharose 4B是法马西亚的预装柱吗, 曾经在中华医学上查到一篇用Glutathione Sepharose 4B作pull down的, 但是没有具体的方法, 不知道你具体怎么做
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发表于 2013-10-8 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，楼主。我是用的法马西亚的预装柱，但是pulldown好象比书上写的麻烦的多：
1 先要用GST与珠子预孵，以除去可能与GST作用的蛋白
2 如果可能的作用蛋白量比较少，要用较多的细胞裂解液或用组织
3 好象银染的蛋白不能做质谱
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koook5695[使用道具]
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发表于 2013-10-8 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哈咯！几位！本人正在做GST pull down.

载体：pGEX-6p-1

受体菌：DH-10B,BL-21（都作了）

用菌体蛋白过的Amersham的柱子。

理论上：谷胱甘肽与GST融合蛋白结合后，用glutathion置换下融合蛋白，跑胶只会出现一条带。可是我的结果出现了几条，不知你们曾否遇到？

另外：我有一蛋白，顽固地不可溶表达，我的IPTG浓度已降到0。1mM,温度已降到16度，2YTA培养基，过夜诱导！ 可否有其它方法改善之？
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发表于 2013-10-8 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
出现几条带也有可能，你的蛋白也许存在多聚体。做个杂交看看哪几条可以反映！

对于后者，不知你的蛋白多大？有什么特别？这么顽固？你检验上清中的蛋白了么？可容表达于不容表达得量的比例大概多少？不是一点都不容吧！

我觉得：可不可以给细菌减少点营养，用1乘YTA做作看看，反正也不麻烦下次做时平行做一个看看吧！
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发表于 2013-10-8 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是新手，但你的问题我刚碰到过，不知以下经验是否适合你：

1.理论上：谷胱甘肽与GST融合蛋白结合后，用glutathion置换下融合蛋白，跑胶只会出现一条带。可是我的结果出现了几条，不知你们曾否遇到？
答：如果你的其它部分没有问题，要注意你的电泳技术是否过关，我的就是因为电泳加样有问题，每次都是多条带，最后终于成一条带了。

2.另外：我有一蛋白，顽固地不可溶表达，我的IPTG浓度已降到0。1mM,温度已降到16度，2YTA培养基，过夜诱导！ 可否有其它方法改善之？
答：有时菌体裂解的方法很重要，更换另一种方法可能就会有可溶了。
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