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标题:【求助】膜蛋白的co-IP问题

finger[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】膜蛋白的co-IP问题


我重组表达的膜蛋白在体内是高表达于红细胞内。目前我已经成功表达该膜蛋白并且免疫小鼠生产了多抗。现在我想用这个多抗进行CO-IP，寻找与之相互作用的蛋白。在园子里查询相关资料，发现有很多问题。
1.膜蛋白的co-IP似乎很难，是吗？我怎样来提取全血（或红细胞）的总蛋白，保证能提取出我需要的膜蛋白，并且保留它与其他蛋白的相互作用？这样需要的血液量是否很多？
2.这样的思路可行吗？
急盼大侠不吝赐教！急！！
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发表于 2013-10-8 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另：我在重组表达这个膜蛋白时用的是裂殖酵母，提取该膜蛋白时有一个裂解液配方用于裂解酵母和抽提膜蛋白，效果还行，但不知道这种裂解液buffer是否适用于血液的蛋白提取，以及是否适用于co-IP。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜蛋白的co-IP是很不好做 反应和洗涤条件很难把握 每个步骤的反应性又都比较低 每种膜蛋白又都不一样
如果膜蛋白是作为bait来做筛选 就更困难
不知道lz是打算筛选 还是只是作为蛋白相互作用的验证
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发表于 2013-10-8 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用生物信息学的方法分析了与这个膜蛋白可能相互作用的蛋白，应该算作是验证吧，希望能得到一致的结果。但我没有做过，并且大家都说膜蛋白做co-IP很难，所以想请教有经验的同学，介绍下经验，或是有没有好的方法，配方什么的，大家帮帮我吧！
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发表于 2013-10-8 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜蛋白一般要用RIPA裂解液，一般的裂解液是裂不出来的。
但是RIPA裂解液会抑制一些蛋白酶类的活性，所以是不是适用还要看你
蛋白的预测底物。或者你也可以选用NP40裂解液，稍微温和一点，但是如果
你的蛋白和其靶点蛋白结合不甚牢固，或者其靶蛋白含量很少的话，IP还是有点难度的。
还有就是样本量要尽量的大一点。
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lxh031[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！还有问题想请教，RIPA裂解液或NP40裂解液能保证提取出需要的膜蛋白，并且保留它与其他蛋白的相互作用吗？我感觉很多提取方法似乎把膜蛋白和胞内蛋白都分开了，不知道我的理解或想法是不是有错误，再次请教，谢谢了！
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发表于 2013-10-8 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是做植物的膜蛋白，用的是Triton X-100，高浓度，1%左右。是比较难做，但还是可以做出来的。
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发表于 2013-10-8 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你是说你做的植物膜蛋白的co-IP，能做出来是吗？那能不能给我介绍下你的总蛋白提取的方法，以及做这个实验的一些经验呢，万分感激！或者我能和你联系下向你请教吗？
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一个比较担心的问题是强裂解液还会一定程度上影响抗原抗体结合。
calbiochem有一种专在温和条件下提取膜蛋白的裂解液，可以先把抗体挂在proteinA/G上，再与裂解液混合。
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finger[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦，那还得考虑裂解液的问题。裂解液是强弱主要根据去垢剂来区分的吧？谢谢大家的帮助！我比较担心的一个问题是提取膜蛋白的同时能否保留它与其他蛋白的相互作用，前面我也问过，就是感觉很多提取方法似乎把膜蛋白和胞内蛋白都分开了，希望这方面有经验的大虾能给予指点。如果哪位大虾做过这方面的实验，可否单独请教，我现在真的很着急，先谢谢了！
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