蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】蛋白质电泳跑胶过程中条带弥散...

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】蛋白质电泳跑胶过程中条带弥散...

any333[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 76446
精华 1
积分 1533
帖子 2542
信誉分 102
可用分 13711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
1
 

【求助】蛋白质电泳跑胶过程中条带弥散...


采用的是5%的浓缩胶,12%的分离较,初始电压120V,到分离较时,增加到200V,但是并没有压缩条带,溴酚兰的颜色很宽,染色后蛋白条带也很宽,想请教下是什么原因可能会导致这种结果。我采用了5倍上样BUFFER,然后与样品1:1稀释,会不会是上样BUFFER太浓了,甘油过多造成的?


查看积分策略说明
附件
2013-10-8 15:29
46267705.jpg (61.15 KB)
 
顶部
DNA[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73137
精华 1
积分 429
帖子 494
信誉分 102
可用分 3291
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-19
状态 离线
2
 
我也遇到过同样的问题,上样BUFFER太浓应该对电泳的影响不大,我们做过不同的buffer电泳,里面的溴芬兰和甘油的浓度不一样,但跑出的结果一样,可以排除buffer浓度的原因。
我做实验室时直接将菌体和buffer混合处理后上样,在弄缩胶能压成一条线,一旦进入分离胶就开始弥散,电泳结果没有你的那么差,可以看清楚。换用好一点的电泳槽时就不会出现这样的问题,估计很大可能还是和槽子有关,以至于影响分离胶的效果。
顶部
any333[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 76446
精华 1
积分 1533
帖子 2542
信誉分 102
可用分 13711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
3
 
我也遇到过同样的问题,上样BUFFER太浓应该对电泳的影响不大,我们做过不同的buffer电泳,里面的溴芬兰和甘油的浓度不一样,但跑出的结果一样,可以排除buffer浓度的原因。
我做实验室时直接将菌体和buffer混合处理后上样,在弄缩胶能压成一条线,一旦进入分离胶就开始弥散,电泳结果没有你的那么差,可以看清楚。换用好一点的电泳槽时就不会出现这样的问题,估计很大可能还是和槽子有关,以至于影响分离胶的效果。

===========================================================================================================

我也是直接将菌体和buffer混合加热后,离心,取上清加样的,电泳槽是六一的,才买了不到一个月,用了大概10次左右,难道是接触不良,导致电压不稳定?
顶部
vvmmoy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79224
精华 0
积分 825
帖子 1270
信誉分 100
可用分 7255
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
4
 

为什么用那么高浓度的上样Buffer?特殊原因?
不要没有道理的对protocol做什么修改,一出问题就很难找原因

上下层胶的PH值有没有问题?
会直接影响到是否能压好条带

电泳时冰浴了没有?
六一场的电泳槽推荐到160V吧,200V的话产热恐怕很明显了

电泳Buffer有没有问题?
我有一次就是SDS少加了90%,也是跑不出条带
顶部
any333[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 76446
精华 1
积分 1533
帖子 2542
信誉分 102
可用分 13711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
5
 


QUOTE:
原帖由 vvmmoy 于 2013-10-8 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

为什么用那么高浓度的上样Buffer?特殊原因?
不要没有道理的对protocol做什么修改,一出问题就很难找原因

上下层胶的PH值有没有问题?
会直接影响到是否能压好条带

电泳时冰浴了没有?
六一场的电泳槽推荐到160V吧,200V的话 ...

用那么高浓度的上样Buffer是师兄要求的,说那样效果好一些。pH应该没问题,这个我们以前跑蛋白都没有冰浴,跑完后升温并不明显。
明天打算再重做下,改变上样Buffer的浓度,同时将所用溶液再检测下,希望能有变化
顶部
6327555[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108888
精华 1
积分 303
帖子 242
信誉分 102
可用分 2042
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
6
 
有一次做PAGE时浓缩胶里也是不聚焦,分离胶里条带弥散,后来发现是电泳液的问题,回收后的电泳液影响了结果。使用新的后图就pl了。
顶部
any333[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 76446
精华 1
积分 1533
帖子 2542
信誉分 102
可用分 13711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
7
 

做了对比试验,用溶菌酶作样品,按4:1,3:1,2:1,1:1添加5倍上样Buffer,结果如图所示,确实是上样Buffer浓度过高。怀疑是甘油浓度高了,准备按分子克隆上的配制上样Buffer,看看到时候效果如何。


查看积分策略说明
附件
2013-10-8 15:33
56776542.snap.jpg (41.94 KB)
 
顶部
loli[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71788
精华 0
积分 736
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6650
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
8
 
SYPRO RUBY有了新的替代品!
继GelRed核酸染料之后,Biotium公司又一创造性发明,蛋白凝胶染料-Lumitei

特性:
1。高灵敏度 ,可检测低至 1ng 或更少的蛋白,灵敏度至少和银染相当。
2。 操作简单 ,固定和染色整合在一步完成,之后仅需漂洗一次。
3。快速染色,30 分钟的快速染色即可获得良好的结果, 90 分钟的基本染色步骤可以获得超高的灵敏度。长时间染色不会造成过染。
4。低背景,染色背景低于 SYPRO TM Ruby 。
5。优越的光谱特性适合各种仪器 ,可以用 300nm 紫外光,蓝光 LED 或 450nm , 473nm , 488nm , 532nm 激光器激发;发射光波长为 610nm (见图 1 )。
6。宽检测线性范围 ,至少三个数量级的线性范围。
7。优越的兼容性 ,可以配合各种 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶和 2-D 凝胶使用;兼容各种下游分析,包括: MS ,序列分析等。
8。稳定 ,染色液在室温下至少可保存 1 年。
顶部
3648755[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77481
精华 0
积分 574
帖子 767
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
9
 

我觉得是你的初电压太大了,建议你用40-80v进行积层胶浓缩,然后加压至120-140v进行分离,直到溴芬兰到分离胶最下沿.当然你的这种情况也有可能和样品本身有关系?
顶部
summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
10
 

可能是电泳液回收次数多了
顶部