【求助】有谁在做WB时候遇到过荧光淬灭？

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标题:【求助】有谁在做WB时候遇到过荧光淬灭？

duoduo[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在曝光的时候，加完AB液，完全黑暗的条件下可以看到很强的荧光，本以为可以得到漂亮的结果，但是PVDF膜一旦包上保鲜膜荧光立即就淬灭了，曝光多长时间都不会再有信号了。
我也试过在看见荧光后直接将底片压上，但仍然是立即就淬灭了。

这种情况也不是经常发生，所以我也找不到原因，好郁闷啊，求助各位大侠了。。。。。

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你加AB液的时间是不是太短了，我们在普通照明情况下，加液后，将膜反扣，3－5min后去曝光。曾经也出现过你所说的现象，是因为时间太短的缘故。

wsll[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的经验告诉，即使加3－5min也会出现他所说的情况，因此我认为和作用时间没太多关系。
第一，首先分析一下，你按照gold的方法，扣3－5min中，这期间荧光会不会粹灭，如果这时候就会粹灭，问题就比较复杂，也许是你过氧化物底物浓度过高，或者特异条带过浓，或者其它什么原因加速了粹灭，总之一般是因为荧光太强而粹灭。
第二，非上述情况，仔细检查一下你的保险膜，是不是有破洞，膜表面残留液体逐渐流失，膜不一定干掉，但也会出现快速粹灭。
第三，你所见的荧光位置是你要的嘛？由于我们采用的是预染markeer，所以容易判断，如果是，你考虑上面的情况；如果不是，可能是洗膜不够充分，沾上的少量非特异的二抗，膜提起的时候或晃动几下，就丢失了。
没办法，重做一下，先排除第二或第三点，如果是过浓的话，下调抗体浓度，试试，或者用旧的抗体嘛，好的抗体用10来次没问题。

NBA[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室去年的时候也碰到过两次类似情况，AB液混合后浇上去很亮，保险膜一包就没了，淬灭很快，最后解决方法是换一盒eclpuls，然后就没事了。不是你膜制备的问题，当时我们所有人的western暴光都是一样，^_^，good luck。

rxcc33[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哈，我们实验室当时也就是换了盒新的ECL：）good luck!

DONT[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那我实验室还出现有的人淬灭快，而其他人正常呢？
我有听说抗体里加了甘油，如果吸取抗体时不注意甘油可能会使荧光淬灭！
所以想知道大家吸取抗体时是怎么吸的？混匀吗？还是在液面直接吸？

66+77[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 DONT 于 2013-10-8 15:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那我实验室还出现有的人淬灭快，而其他人正常呢？
我有听说抗体里加了甘油，如果吸取抗体时不注意甘油可能会使荧光淬灭！
所以想知道大家吸取抗体时是怎么吸的？混匀吗？还是在液面直接吸？ ...

我也碰到这样的问题啊，后来有人说是我的上样蛋白太高了，我把上样量降低后，翠灭就不会那样快了，我用的是上海普飞的，不过现在也买了ＰＩＥＲＣＥ的，我也怕是ＡＢ液的问题．．．．

DONT[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们碰到的问题是前面和后面都有人做出来,说明AB液没问题,但有的人就是显不出来.不知道什么原因,我自己也碰到过.而且strip之后有时出来有时不出来，难到真实上样蛋白太高了？

再问一下：你们吸取一二抗时是怎么吸的？先混匀吗？还是在液面直接吸？

98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同意三楼的意见：荧光越强粹灭越快，应考虑降低抗体浓度或上样蛋白量；
另外洗涤时应充分洗干净，这很重要！
但抗体使用时最好应分装，因抗体使用久了会很快失效。

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-10-8 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我碰到的问题比较奇怪
加第一遍AB液,没有出现可见的荧光,反应时间4~5分钟,压片10分钟,一条带也没压出来.
补加了两次AB液,可以看见很强的荧光,但很快就粹灭了
?????????
有点不明白
我还以为是抗体浓度太低了,
今天把膜striping一下,重新做,不知结果会如何

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