【求助】毕赤酵母表达后跑SDS-PAGE出现奇怪的条带

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标题:【求助】毕赤酵母表达后跑SDS-PAGE出现奇怪的条带

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发表于 2013-10-9 09:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用毕赤酵母X-33表达大小约为66KD的糖化酶，诱导7天后，将上清经过TCA浓缩后跑SDS-PAGE，在预期的位置没有出现目的条带，但在大约100多KD处却出现了一条比较浓的带，量也较大，并且空白对照没有此条带。因为怀疑是由于二硫键形成的二聚体，所以我又用巯基乙醇将样品处理了一下，基本上没有这条带了，只能看到比较模糊的印，但是依然没有我想要的目的条带。这个奇怪的现象困扰了我很久，问过很多人都无法解释。如果说这条带是酵母自身分泌的蛋白，那为什么空白对照就没有呢？而且毕赤酵母表达时，目的蛋白如果有表达的话，应该占到总蛋白的90%左右，以这条带的量来看，我感觉不会是背景蛋白，什么背景蛋白会占这么大的优势，达到这么大的量呢？我感觉这就是特异带，因为空白对照明显没有此带，但是它的位置就是不对！请各位酵母表达的高手指点我一下！

avi317[使用道具]
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发表于 2013-10-9 09:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是被修饰了，你最好是吧电泳图传一份上来看看

qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-10-9 09:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

诱导7天后，将上清经过TCA浓缩后跑SDS-PAGE，
如果说这条带是酵母自身分泌的蛋白，那为什么空白对照就没有呢？

=====================================================

空白对照是什么？未诱导的上清？是否和诱导上清一样经过了TCA浓缩？

qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-10-9 09:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

而且毕赤酵母表达时，目的蛋白如果有表达的话，应该占到总蛋白的90%左右，

==========================================================

说说而已。
一般毕氏酵母自身分泌的蛋白是不多。
但表达的外源蛋白，在我们通常的表达水平下，也绝对达不到总蛋白的90%。

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发表于 2013-10-9 09:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

没有经过巯基乙醇处理的那张电泳图没有留底，有的这张是经过处理之后的，就是每900微升样品里加了10微升的巯基乙醇，然后才进行的TCA浓缩，这张图从右至左依次是蛋白Marker,空白对照，空白对照，168h,144h,120h,96h,72h,48h,24h。现在这张图中那条带已经看不太清楚了，原来那张照片中，那条奇怪的带特别浓。说明一下，我的空白对照是转化了空质粒载体的酵母菌，一样的条件下同时进行的诱导，同样经过了TCA浓缩。我把照片发上来，请老师们帮我分析一下。

附件

2013-10-9 09:58

91956023.snap.jpg (17.17 KB)

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发表于 2013-10-9 09:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我说错了，是从左至右，不是从右至左，最上面那条Marcker应该是97KD左右。

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发表于 2013-10-9 09:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

原来那条奇怪的带就是我用红色圈出来的位置。

附件

2013-10-9 09:59

32252308.jpg (80.53 KB)

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发表于 2013-10-9 10:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外，我还有个问题要问一下各位老师，我这次又重新进行了一次诱导，这次我是严格按照毕赤酵母表达手册上做的，就是我先用50mL含甘油的培养基将酵母菌养到OD约为4左右，然后用原培养体积5分之一的含有甲醇的诱导培养基将菌体沉淀重悬，也就是10mL，使使OD值在20左右，然后开始诱导表达，但是因为我出了跑胶，还要进行酶活的测定，所以我每天取样2mL。但这样的话，再算上培养基每天蒸发的量，估计还没有诱导完，发酵液就干了。所以我每天在取样2mL后，又补加2mL左右的培养基，也就是说让培养基的体积基本保持在10mL ，然后添加10mL的0.5%的甲醇。考虑到补加的培养基中叶含有甲醇，我怕补多了，所以就配了不含有甲醇的诱导培养基。但有的人说，补加培养基很不好，会对蛋白的表达产生不利的影响，是这样吗？那是不是说我这一次依旧表达不出来呢？

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发表于 2013-10-9 10:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从你的电泳图上看，24－48小时表达应该是可以的了。是外泌表达还是什么？如果是外泌表达的话也太不纯了。糖化的程度怎么样？如果高糖化的话，电泳完全有可能跑的很慢，不能用marker来确定蛋白。

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发表于 2013-10-9 10:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在这次表达之后，我觉得是没有表达，所以又重新诱导了一次，上次我采用的是Mut+的诱导方案，我这次采用的是Muts的诱导方案，结果又出现了这条奇怪的带，我用的是毕赤酵母分泌表达一个大约66KD的糖化酶，这次的带很漂亮，但是比我的目标蛋白也大太多了，但我用软件分析了一下，我的蛋白中并无糖基化位点啊，但我觉得应该不是酵母自身的蛋白，因为自身蛋白怎么会有这么高的浓度啊！而且带这么明显，也很单一，并且还挺符合酵母诱导的规律，72h和96h的时候量很大。下面的图就是我这次新诱导的蛋白电泳图，从左到右依次是24h、48h、72h、96h、120h、144h、空白对照和Marcker(最上面的是97KD)。我现在实验已经无法进行下去了，因为根本找不到原因，也根本无法确定我的蛋白是不是表达了，现在根本就不知道这条奇怪的带是什么，真的很着急，请高手指点我一下！

附件

2013-10-9 10:13

47340280.snap.jpg (14.11 KB)

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