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标题:【讨论帖】蛋白常用lysis buffer组成与作用详谈

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发表于 2013-10-9 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】蛋白常用lysis buffer组成与作用详谈

先介绍一下我们用的：

PBS
缓冲液，不用多说；

TRITON X-100
Triton X-100中文名为曲拉通X-100，分子式为t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH, x=9-10，平均分子量为647。 常用的非离子性去垢剂，主要是去垢的作用；

PMSF
PMSF即Phenylmethanesulfonyl fluoride，也称Phenylmethylsulfonyl fluoride或α-Toluenesulfonyl fluoride。中文名为苯甲基磺酰氟。分子式为C7H7FO2S，分子量为174.19。可抑制丝氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)，也可抑制半胱氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶。有效浓度为0.1-1mM。难溶于水，且在水溶液中非常不稳定；

LEUPEPTINE
Inhibition spectrum: inhibits serine (trypsin (Ki=13 µM), plasmin, porcine kallikrein) and cysteine proteinases (papain, cathepsin . Does not inhibit chymotrypsin and thrombin.
Mechanism of action: Competitive and reversible inhibitor. Inhbition may be relieved by an excess of substrate.
Properties: Soluble in water, ethanol, acetic acid and DMF (Stock solution: 10 mM)
MW: leupeptin: 426.6; leupeptin hemisulphate monohydrate: 542.7
Suggested final concentration: 1-10 µM (0.5-1 µg/ml)；

PEPSTAIN
Inhibition spectrum: potent inhibitor of various aspartic proteinases e.g cathepsin D, renin, pepsin, bacterial aspartic proteinases and HIV proteases. Not selective at all.
Mechanism of action: Transition state analog.
Properties: First isolated from culture filtrates of various species of Streptomyces. Analogs of pepstatin have been designed in order to increase the selectivity and potency of the inhibition. Soluble in DMSO or methanol (Stock solution: 1 mM); Stable at -20°C.
MW: 685.9
Suggested final concentration: 1-5 µM；

整个实验室都在用这个组成，蛋白沉淀加入lysis buffer之后，进行常规超声处理， 效果还可以。
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2013-10-9 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PMSF是一种常用的蛋白酶抑制剂。但很多商品化的复合蛋白酶抑制剂中是否已经包括PMSF的成分或功能？问个先。
还有Triton X－100，应该是多大浓度才能算是一种比较温和的裂解成分？
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 小中大

缓冲液要根据后续的处理过程进行选择，不宜统一选择PBS
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junjie05[使用道具]
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 小中大
PMSF是一种常用的蛋白酶抑制剂。但很多商品化的复合蛋白酶抑制剂中是否已经包括PMSF的成分或功能？问个先。
还有Triton X－100，应该是多大浓度才能算是一种比较温和的裂解成分？

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1。 既然2002提到”PMSF可抑制丝氨酸蛋白酶，也可抑制半胱氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶“。我个人使用的商品化的蛋白酶抑制剂cocktail（例如罗氏和sigma）不含有PMSF，但含有丝氨酸蛋白酶抑制剂多个，应该说包含PMSF的功能。使用时可以另外添加PMSF，也可以不添加。
2。Triton X－100本身就是一个温和的非离子去污剂，一般使用浓度为1％。离子型去污剂SDS具有变性左右，可以算是一个比较剧烈的去污剂。通过多个去污剂组合裂解液增强了裂解效果甚至可能破坏极少部分蛋白，比如经典的三去污裂解液（1％SDS，1％ triton X－100，1％ NP－40）。可以通过个人的摸索适当改变去污剂的用量和种类，比如降低SDS至0.25%，增加1％的脱氧胆酸钠，甚至仅仅使用triton X－100或者SDS的单去污。裂解效果和蛋白破坏是一对矛盾－－使蛋白裂解效率增加的同时也使蛋白破坏几率增加，要保护蛋白就需要冒裂解不完全的风险。其实实践操作绝大部分蛋白都可以比较完整和完全的裂解下来，二者有冲突的只是极少数而已。
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发表于 2013-10-9 10:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
缓冲液要根据后续的处理过程进行选择，不宜统一选择PBS

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我所知道的常用的缓冲液PBS，Tris-HCl，HEPES-NaOH。由于它们共轭酸根等电点的不同，所以最佳缓冲范围有别，越偏离等电点，则缓冲能力越弱。具体内容我不是十分清楚，请知情战友补充。
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 小中大
PMSF是一种常用的蛋白酶抑制剂。但很多商品化的复合蛋白酶抑制剂中是否已经包括PMSF的成分或功能？问个先。
还有Triton X－100，应该是多大浓度才能算是一种比较温和的裂解成分？

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的确，一般的复合蛋白酶抑制剂都有pmsf，但是按照他们说明书上的，很多时候浓度还是太低，我有个蛋白，比较重要，加了复合抑制剂，还是很容易降解，后来我加了10mM的PMSF，结果蛋白就不再降解了。
PMSF应用如此广泛，真的很有效的。
但是毒性也是特别大了，一定小心。
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发表于 2013-10-9 10:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我所知道的常用的缓冲液PBS，Tris-HCl，HEPES-NaOH。由于它们共轭酸根等电点的不同，所以最佳缓冲范围有别，越偏离等电点，则缓冲能力越弱。具体内容我不是十分清楚，请知情战友补充。

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除了最常见的pbs，tris-HCl缓冲液： pH＝7.5～8.5之外，还有以下几种常用的buffer。


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发表于 2013-10-9 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我所知道的常用的缓冲液PBS，Tris-HCl，HEPES-NaOH。由于它们共轭酸根等电点的不同，所以最佳缓冲范围有别，越偏离等电点，则缓冲能力越弱。具体内容我不是十分清楚，请知情战友补充。

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除了楼上补充的几个以外，我把抄在notebook上的东西跟大家分享一下（忘记是从哪个试剂公司上复印的了，呵呵）.很多试剂公司在瓶子上标了有效buffer范围的。

ACES: 6.1-7.5
Bis-Tris: 5.8-7.2
Bis-Tris propane: 6.3-9.5
HEPES: 6.8-8.2
HEPPSO: 7.1-8.5
Imidazole: 6.2-7.8
MES: .5.-6.7
MOBS: 6.9-8.3
PIPES: 6.1-7.5
POPSO: 7.2-8.5
Glycin: 8.6-10.6
HEPBS: 7.6-9.0
Soldium HEPES: 6.8-8.2
Tris: 7.0-9.0
TEA: 7.3-8.3
TES: 6.8-8.2
Tricine: 7.4-8.8
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 小中大
我用的lysis方法：

1. 用液氮＋37度水浴反复冻融3次（以上）。（帮助破碎细胞）

2. 加入lysis buffer: 50 mM Bis-Tris propane, pH 7.0; Boehringer Complet protease inhibitor (Cocktail) (one tablet for 10 g E. Coli.); Lysozyme; （protease inhibitor的作用首贴中20021108版主已有说明。这种cocktail是推荐在E. Coli中使用的。Lysozyme, wiki上的解释比较全面了，copy过来：

cuturl('http://en.wikipedia.org/wiki/Lysozyme')

Lysozyme (BE: lysosyme) is a 14.4 kilodalton enzyme (EC 3.2.1.17), commonly referred to as the "body's own antibiotic" since it kills bacteria. Lysozyme is a an enzyme that destroys bacterial cell walls by hydrolyzing the polysaccharide component of the cell wall.[1] It is abundantly present in a number of secretions, such as tears. This protein is present in cytoplasmic granules of the polymorphonuclear neutrophils (PMN) and released through the mucosal secretions (such as tears and saliva). They can also be found in high concentration in egg white.

3. 30 度1 h. keep stiring.

4. 冰水浴超声。(Sonicator XL-2020, 30% power, 0.1 S cycle, 1 h)
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嗅嗅[使用道具]
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我们这里用到的是1%，原来的实验室用到的是4%，两者的效果比起来，我觉得还是前者的效果好些
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