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标题:【求助】关于毕赤酵母发酵的问题

8princess8[使用道具]
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发表于 2013-10-9 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于毕赤酵母发酵的问题


最近我在做酵母发酵的问题，GS115，按照invitrogen protocol操作，头一次做，没经验，以下是我遇到的一些问题，恳请大家赐教：
1、我按10％的接种量接种，OD600达到了6，发酵罐培养的20小时，DO到了最低的百分之五十多，然后开始慢慢的往上升；是不是这时是它的对数期啊？invitrogen上说，DO会一下子升到100％，当甘油耗尽时，可到32小时后还只是80％左右，没有升到100％，没做过，不知会不会达到100％；假如能达到，一般达到100％需时间多久？
2、流加甘油，一般加多少量？流加多久？流加完就可以用甲醇诱导吗？
3、发酵过程中会有大量的泡沫产生，要不时加消泡剂，我用的是硅酮，不知大家有没有消泡效果更好的，谢谢！
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8princess8[使用道具]
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发表于 2013-10-9 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DO是发酵的重要指标，但是随着培养基，发酵罐，种子生长质量等多个因素都有直接的关系，不能完全照搬的；此外，国外的mannual很多时候也不能照搬，很多情况汇报都是如此。特别提示：溶氧电极一定要标定准确，要不然会害死人的!

关于甘油的流加主要是为了大道比较大的细胞生长量，便于后续甲醇诱导时的高表达，具体也是与发酵罐有关的，具体的量化值可能需要摸索一下。

硅酮时比较常用的，应该没问题的
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ending[使用道具]
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发表于 2013-10-9 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

种子OD值为6应该没有问题。我们一般在20小时左右培养基中的甘油消耗完，DO迅速上升，最后到100%以上。您有可能是DO电极没有标定好，当然还跟您的发酵底料中的甘油含量有关，Protocol中甘油为4%。一般为15-20ml/hr，每隔1hr做DO SPIKE ，防止甘油积累。甘油补料依据到理想的湿重为止，可以4-6hr，也可以10来小时，经过半个小时以上的饥饿期，可以开始甲醇诱导。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-10-9 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

只要DO在急短的时间内（大概三四分钟吧）急剧上升，一般可判定甘油已经耗尽了，不用非得等到DO100多.
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8princess8[使用道具]
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发表于 2013-10-9 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位战友的指导：
我发酵罐的溶氧电极很准的，我又做了一次，30h后，DO还是没有上升到一百，我的底物甘油的含量是4％，应该和你们的条件不会有太大差别吧，可发酵的时间咋会差这么久啊？
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发表于 2013-10-9 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

手册上说的不一定和我们现实中的情况完全吻合。
发酵之前还是最好阅读一些文献资料。发酵得时候很多情况都是变化，很多时候都需要我们当场要给出解决的方案，所以有一些知识的准备是必要的。
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8princess8[使用道具]
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发表于 2013-10-9 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这次发酵又不行，上清没有我想要的小肽。
整个发酵过程大概如下：
100ml OD约7接种到1200ml basal salts中；
32h后（DO只有60％左右），流加50％甘油含PTM1约250ml，中间约有两小时DO小于20％，不知这个影响大不大？流加10h左右！
饥饿三小时，开始100％甲醇含PTM1的流加，5ml/h流加5h，再提高到12ml/h流加，整个流加过程中，DO 都很高，有百分之七八十，发酵液没有出现绿色。
我每隔8h取样，检测，没有！
谢谢啦
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8princess8[使用道具]
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发表于 2013-10-9 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也查了一些资料，都是怎么优化的啊，还有写的也不是很详细，也不知该怎么做啊，很急啊！麻烦各位了！！
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发表于 2013-10-9 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DO SPIKE就是指甘油或甲醇补料过程中停止补料，看DO迅速上升10％所需要的时间，如果小于30秒，一般认为没有积累，如果大于30秒，认为补料太快，要等溶氧上升10％后再开启补料泵。
您发酵时一直在看罐吗？我们是一直在边上值班的。好像32小时甘油消耗的太慢了，文献中也就20来个小时。您说50％甘油含PTM1约250ml什么意思？
您用的是什么表型？MUTS？补料是蠕动泵还是脉冲泵？建议您用蠕动泵补甲醇。诱导过程需要一步一步的来，酵母对高浓度的甲醇还是很敏感的，建议您先用50％甲醇诱导，待PH下降。酵母适应甲醇后，再切换到100％甲醇，一般是每小时增加1ml/h.l的补料速度，不可以太快。从您说的看来，再甲醇诱导过程中酵母已经被甲醇杀死了，因为您的溶氧太高，甲醇会把酵母渍死的。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-10-9 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你们做时一直看着啊？我就一个人，没有那么大的精力，呵呵。
就是说流加50％的甘油啊。里面含有PTM1，流加了大概有250ml；我的是Mut＋，GS115,是蠕动泵。
那你的最后最大补料速度是多少啊？
可能是甲醇把我的酵母给杀死了啊，呵呵，加了有点快了！
还有我可不可以甘油流加富集后，离心，重悬于不含甘油的basal salts中，流加甲醇诱导表达，我就是怕甘油没消耗完，会抑制表达，可行吗？
谢谢！还有诱导时溶氧一般控制在多少啊？
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