【求助】关于包涵体蛋白的复性，浓缩，纯化。。。

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】关于包涵体蛋白的复性，浓缩，纯化。。。

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】关于包涵体蛋白的复性，浓缩，纯化。。。

prettygirl@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 107994
精华 0
积分 262
帖子 244
信誉分 100
可用分 1996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态离线

发表于 2013-10-9 14:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我目前要做一种受体蛋白的纯化。。
1已经用大肠杆菌表达出这个受体蛋白的调节部分的蛋白
2因为是表达在包涵体，所以要从中提取，因为以前的前辈的方法，蛋白后来没有活性。所以现在用胍盐酸变性，加表面活性剂，然后用cyclodextrin的包接作用去掉表面活性剂来复性。
3复性率还可以反，但是反应后如果不马上处理，就会出现沉淀。我想大概是表面活性剂或者cyclodextrin的溶解度在4度，溶解度低的关系。
4最终蛋白的浓度很低，如果直接浓缩，蛋白损失特别大。如果先透析，透析液用的量很惊人。
5已经尝试用硫氨沉淀，结果不行。表面活性剂或者环状糊精跟着一起沉淀了。

我该怎么办呢？超滤离心浓缩也不行，沉淀。。。我想主要是表面活性剂或者环状糊精的关系，可是如果不透析，怎么除去呢？

帮帮我吧，因为想做蛋白的活性要求1mg/ml左右的浓度
而且还不知道活性如何？如果没有，就要想别的方法
可是现在停在这一步。。。
真是犯愁。。。

rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态离线

发表于 2013-10-9 14:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

既然已经复性了,蛋白的等电点也比较清楚,而那些表面活性剂也没有离子,你可以直接过离子交换柱挂上,然后洗脱,就可以达到浓缩的目的,如果蛋白比较容易聚集,可以适当加点甘油看能不能避免蛋白沉淀,此外你说复性效率可以只是溶解性而言,建议还是测定活性怎么样再进一步浓缩处理,如果没有活性还得做复性直到有活性为止,其实我做复性不多,只是一点建议.

prettygirl@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 107994
精华 0
积分 262
帖子 244
信誉分 100
可用分 1996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态离线

发表于 2013-10-9 14:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
头痛
谢谢
是啊，我表达的不恰当
不是复性率不错，而是溶解度不错
因为复性不复性要看最终是不是有活性才能说的吧！

我觉得头疼的就是表面活性剂。。。
如果浓度低的已经refolding的蛋白溶液，浓度很低，大概0.03mg/ml左右。能用离子交换层析吗？因为我当时是考虑到后来的纯化，表达的时候加近了his-tag。而且我的反应液的量很大的。要想完成目标的量，大概要有80ml的蛋白溶液。

prettygirl@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 107994
精华 0
积分 262
帖子 244
信誉分 100
可用分 1996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态离线

发表于 2013-10-9 14:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目前的矛盾就是

主要是要测活性才要做binding assay的

但是要求蛋白溶液的浓度高

目前浓缩出了问题，无法测活性

我的最终目的是要纯化的蛋白结晶，做x线衍射结构分析。。。。

8s5g[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77636
精华 0
积分 469
帖子 538
信誉分 100
可用分 3626
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2013-10-9 14:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那最好是带his标签,亲和纯化或者柱上复性,理论上纯度越高,复性的效率也越好,而且带标签纯化也方便,即使只有0.03mg/ml也可以用离子交换,没有问题.象疏水,亲和,离子交换并不要求起始浓度,我用疏水和亲和都做过20mg/L的样品,它们本身都有富集的效应,

prettygirl@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 107994
精华 0
积分 262
帖子 244
信誉分 100
可用分 1996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态离线

发表于 2013-10-9 14:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢
还有几个问题
1，如果做亲和层析的话，那表面活性剂不会有影响吧？我是不是要用很大的一个column呢？而且NI-NTA也要用很多吧？具体怎样操作呢？是平衡后，把那个蛋白溶液全部加进去让蛋白挂柱呢？需要很长时间吗？
2，如果做柱上复性的话.可以重复利用吗？
3，关于离子层析，目前不知道等电点，可以做离子层析吗？

PCR[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74238
精华 0
积分 414
帖子 448
信誉分 100
可用分 3201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态离线

发表于 2013-10-9 14:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

表面活性剂没有影响,还可以降低非特异吸附,多大的柱子看你多少填料,要多少填料取决你要做多少蛋白,具体的操作难写很清楚,pM你邮箱给我,我发材料给你吧,操作都有,柱上复性柱子还是可以重复利用的.离子交换不知道等电点也可以做,试试阴柱或者阳柱就可以.

prettygirl@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 107994
精华 0
积分 262
帖子 244
信誉分 100
可用分 1996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态离线

发表于 2013-10-9 14:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
普通感冒
谢谢大人
您真好。。。

我用过你头像的这个产品
手头上也有说明书。。。不过是英文的

还好，我用的表面活性剂是非离子型的
这个蛋白对离子型的表面活性剂不感冒。。。当时讨论过了。。。
这个能说明点什么问题呢？？？

我算了，如果是按照binding capacity的话，需要的NI-NTA agarose的量很少的

PCR[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74238
精华 0
积分 414
帖子 448
信誉分 100
可用分 3201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态离线

发表于 2013-10-9 14:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

变性条件下载量没有天然的高，至于填料NTA和IDA的都可以，表面活性剂不影响，复性相关材料也随信发了。

eve_49[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 114521
精华 1
积分 246
帖子 168
信誉分 102
可用分 1613
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2013-10-9 14:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好，我有一个GST纯化的问题想请教您。我拿别人诱导的蛋白做GST纯化时，发现洗脱缓冲液的mAU值在400~500，而且上升到该值之后一直是平行的，不会向成功的洗脱蛋白时有一个峰，我把柱子卸下来后在重复跑平衡液和缓冲液，发现也是同样的曲线。我配的缓冲液是根据GE的说明书来配置的，怎么会出现这种情况？我拿洗脱液跑过胶，里面没有目的蛋白，但别人之前一直纯化得很好。