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标题:【求助】请教保护碱基的个数

c86v[使用道具]
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发表于 2013-10-9 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教保护碱基的个数

记得看到过人说每个限制酶的保护碱基并不是随便加的，正好面临这个问题，请教主任及各位，BamH I和Hind III的保护碱基应该几个为好？添加什么碱基为好？多谢!
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youyou99[使用道具]
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发表于 2013-10-9 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
保护碱基的个数与种类与酶切位点种类无关

要看您的引物长度，Km值，GC含量以及序列而定

如果您的引物长，那就少加

如果您的引物两个长短不一,可以短的多加。我就作过！

如果因物ＧＣ含量已经很高，那就加点儿AT，还可以协调两引物的Km值差异，应用起来很灵活的！

另外加完之后，应该分析一下又无自身发卡结构，又无二聚体（特别是有无因为保护序列引起的，尽量避免）

５‘端的碱基种类并不是要求很严，也不是很重要，反正做完后酶切就掉了！道是３’多考虑一下！！

个人意见！希望有用！

欢迎来“蛋白天堂”交流

祝试验成功！
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c86v[使用道具]
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发表于 2013-10-9 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
ccDNA您的附件中所列的这两个酶的保护碱基全是G或C啊!本来我的引物GC含量就很高了!我以前都是象Fredric所言，GC多了加AT，AT多了加GC，现在看得多了反倒不知道怎么样好了。

我不加保护碱基中间转个T载体是不是也可行？
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2013-10-9 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是NEB公司的资料，***本上是限制性内切酶最权威的资料。
引物GC含量和保护碱***有关系吗？
保护碱***是为了提高酶切效率的，它并不和模板互补，所谓GC含量是针对和模板互补的序列吧？
算Tm值只能算互补的序列，不互补哪来Tm值？可见GC含量和它一点关系都没有。
T载体当然可以，只要你不怕麻烦舍近求远。
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c86v[使用道具]
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发表于 2013-10-9 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
保护碱基是否在Tm考虑范围之内的问题，有不同的看法。PCR最初几个循环用不到保护碱基，但以后的循环都得和保护碱基互补。Yong主任还有很多其他园友都认为不考虑比较科学，不过我一向考虑的，不过不论是否考虑，单纯在理论Tm基础上降5度的一次成功性很小，一般都得做一些调整，所以这只是个参考值而已。我想这些东西都是书上写的死东西，真正做起来还得看效果，您说呢？
cccDNA，真的很感谢您提供的NEB公司的资料，有同学向我推荐过，我一直没找到，已经收藏了，谢谢!
至于T载体，听人说有的时候中间转一下可能更顺利，不过我没用过，以前也是一直PCR产物双切后直接连的，没有T载体的经验。我自己想加几个不太多对GC含量影响也不大的保护碱基，如果双切直接连顺利的话最好，万一出点问题就转T载体，自己想起来也觉得麻烦，见笑了
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发表于 2013-10-9 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在某版贴过的关于保护碱基可能与你的意思有点不同，公司提供的保护碱基是为了提高内切酶效率的，不是为了PCR中丢失保护的（和 Frederic 说的就合上了）。
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发表于 2013-10-9 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PCR成功的关键也是最初几个循环的质量阿，所以不考虑是比较恰当的。
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发表于 2013-10-9 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得，算上保护序列计算Km值，这样得出的退火温度会偏高，P时会特异性增强，如得不到目的条带，则降低一些~~摸索这做吧！我一直是这样做的！PCR是要摸条件的！
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发表于 2013-10-9 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

保护碱基的组成当然可以随便加，NEB也有推荐的数据，但请仔细看它的反应条件，并不完全相同，而且公司不可能什么碱基都试，CG含量没必要考虑，保护碱基的个数可参考NEB，但不是绝对，象你这样好切的酶，加两三个就没问题了，我都这么做，如果担心，建议加三四个。
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发表于 2013-10-9 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实保护性碱基目前的资料是那么几个公司做的，他们没有试过的并不等于不行，因此只能算作参考价值。
GC含量太高了确实不好，我以前也做过类似的，按照biolab的protocol，pstI的保护性碱基有十几个。两条引物的Tm值能差二十度。后来我用pfu酶p完后加A连到T载体过渡一下，轻松搞定。
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