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标题:【求助】western blot 不出条带,是一抗孵育不上的原因吗?

ilovegaga[使用道具]
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发表于 2013-10-9 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot 不出条带,是一抗孵育不上的原因吗?


最近做western blot ,电泳,转膜感觉没问题,转出的膜用丽春红染色,条带清晰,用5%的脱脂奶粉封闭1小时,加一抗,一抗用TBS稀释,另加5%BSA,4度过夜,用TBS洗膜,3次,10分钟/次,加二抗,二抗用TBS稀释,37度孵育1小时,用TBS洗膜,3次,10分钟/次,显影,定影,结果没有任何条带,感觉步骤没有问题,就是不出带,是不是一抗孵育不上的原因吗?谢谢大家.
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7437654[使用道具]
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发表于 2013-10-9 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
条带没有出来 原因可多了 要慢慢排除
“转出的膜用丽春红染色,条带清晰” 说明你转膜是没有问题的
那么一抗 二抗的浓度你要摸摸，建议从大的浓度开始摸
慢慢降低抗体的浓度。
当然也要确保抗体没有失效。
发光液注意不要过期了 可以加少量二抗与发光液混合 在暗室里观察 有无荧光，如有 表明二抗 与发光液是没有问题的
显影 定影是最后一步，如果抗体结合的好 但压片不成功 也是非常遗憾的
所以要确保显影液和定影液是好的
祝你成功！
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发表于 2013-10-9 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近做western也是这样，条件跟以前一样。郁闷。
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am10[使用道具]
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发表于 2013-10-9 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还要看看你的样品保存的怎么样，不会目的蛋白降解了吧，用新样品试试。
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ilovegaga[使用道具]
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发表于 2013-10-9 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢,我把二抗和发光液混在一起,发现荧光很亮,看来二抗没问题,不清楚是不是抗体浓度的问题?我一抗1:1000稀释,二抗1:20000稀释,用这个稀释浓度,有一个蛋白可以出条带,但另一个蛋白不出条带,不知道是什么原因?
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发表于 2013-10-9 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是否存在其中一个降解的问题？
两个蛋白的上样浓度是一样的不？
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发表于 2013-10-9 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同一个总蛋白，检测的目的蛋白不同，上样浓度也一样
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发表于 2013-10-9 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也碰见和你一样的情况，现在我二抗4度过夜可以看到蛋白，我怀疑是一抗和二抗结合能力较差，所以没有条带
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yysr238[使用道具]
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发表于 2013-10-9 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

条带没有出来 原因可多了 要慢慢排除
“转出的膜用丽春红染色,条带清晰” 说明你转膜是没有问题的
那么一抗 二抗的浓度你要摸摸，建议从大的浓度开始摸
慢慢降低抗体的浓度。
当然也要确保抗体没有失效。
发光液注意不要过期了 可以加少量二抗与发光液混合 在暗室里观察 有无荧光，如有 表明二抗 与发光液是没有问题的
显影 定影是最后一步，如果抗体结合的好 但压片不成功 也是非常遗憾的
所以要确保显影液和定影液是好的
祝你成功！

您说得很有道理，我有一个问题想请教一下，那如何排除一抗是不是过期失活了的问题呢？谢谢了
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发表于 2013-10-9 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也有可能是一抗和二抗结合能力太差，我也碰见这样的情况，二抗与发光液混合 在暗室里观察 有荧光，我也怀疑是一抗的问题，后来二抗4度过夜，就有了条带，而且很漂亮，你也可以试一下
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