【求助】15%分离胶总是跑出笑脸

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标题:【求助】15%分离胶总是跑出笑脸

雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2013-10-10 10:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

先发两张比较典型的图。都是15%的分离胶跑出来的，一两个星期都是这样的，急死我了，期间也有跑的10%的胶是很正常的，途中两边是上样缓冲液，中间是MAKER，其余是样本。
也找了园子中各种帖子，改变了各种条件：
（1）先是重新配置了各种溶液，PH计刚买的，丙烯酰胺也进行了过滤，我的胶都是配置成母液的，应该不会存在着混合不均匀的问题。
（2）改变上样量，甚至减少至上样5微升，同样是这样的，我的蛋白浓度也不是很高。
（3）减小电压（我用的是恒压），浓缩胶从80V到50V，分离胶从130V到100V都跑过，但是也没能解决问题，低电压上半段是直线，中间就开始扭曲了，下半段还是会变成笑脸。
（4）尝试了冰浴，减少散热不足导致的胶变形，但是结果和（2）的结果一样，只在前半段比较好，后半段就不行了。
而且右图是在进入分离胶前条带已经被压缩成一条细带的，跑下来不仅是笑脸，溴酚蓝也散的比较严重，
真的很急很郁闷，不知道现在要怎么办了

附件

2013-10-10 10:31

85335272.jpg (5.64 KB)

wood533[使用道具]
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发表于 2013-10-10 10:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该是你的胶凝的不好~~
看不太清楚你的图，但电泳不需要冰浴的，室温跑就可以，电流不是太大，初步建议你再做胶时凝时间长点，尤其是分离胶，跑的过程中可以注意一下电流的变化~~

雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2013-10-10 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

因为分离胶在刚倒好加好去离子水就能看到一条很明显的折线，我以为是凝的太快还减少了凝胶时间，现在是分离胶1.5小时，浓缩胶1小时，您建议的时间是多少？我试试

wood533[使用道具]
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发表于 2013-10-10 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分离胶在刚倒好加好去离子水就能看到一条很明显的折线

==================================================================================

这个的确不太正常，有点太快了，检查你是不是凝胶的配方有错，或者加AP、TEMED时哪个是不是加多了~~
过快或者过慢凝都不好

雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2013-10-10 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

5ml配方是：
30%ACR/BIS:2.5ml 1.5mol/L Tris-Hcl(Ph 8.8) 1.25ml 超纯水 1.25ml 10%SDS 50微升 AP：25微升 TEMED 3微升
这个AP是不是太多了？量是不是随着胶浓度的提高降低的？

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发表于 2013-10-10 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 雪山飞鹿 于 2013-10-10 10:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

5ml配方是：
30%ACR/BIS:2.5ml 1.5mol/L Tris-Hcl(Ph 8.8) 1.25ml 超纯水 1.25ml 10%SDS 50微升 AP：25微升 TEMED 3微升
这个AP是不是太多了？量是不是随着胶浓度的提高降低的？ ...

我也觉得原因在于胶凝得不好。没有出现漏胶的情况吧？两侧没有塌陷渗漏吧？
建议分离胶：30%ACR/BIS:2.5ml 1.5mol/L Tris-Hcl(Ph 8.8) 1.3ml 超纯水 1.1ml 10%SDS 50微升 AP：50微升 TEMED 3微升。以前我们实验室就是这个配方，没出现什么问题。
一加上去离子水就有明显的折线很不正常，但是不知道你说的明显折线是什么样的，如果是从不同角度看到液面的分界那么是正常的。我加去离子水压胶的时候，从一侧加进去，一侧的胶液面会向下沉一沉然后返回到平衡线，也是可以明确看到液面分界的。

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发表于 2013-10-10 10:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 雪山飞鹿 于 2013-10-10 10:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

因为分离胶在刚倒好加好去离子水就能看到一条很明显的折线，我以为是凝的太快还减少了凝胶时间，现在是分离胶1.5小时，浓缩胶1小时，您建议的时间是多少？我试试 ...

那个折线很可能是液面分界而已，不是凝好了。但是这个凝胶时间也可以了。所以我觉得原因在于你的配方，将AP的量增加至50μl，胶可能就凝得比较好了。

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发表于 2013-10-10 10:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

胶刚配好有条分界线的情况我也遇到过，但是没影响的，很快就看不到分界线了，AP与SDS的量是1:1加入的。再就是以前我们实验室也出现过溴酚蓝看着很分散的情况，后来换了新的蛋白loading就好了，你也可以考虑试试。

wood533[使用道具]
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发表于 2013-10-10 10:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再补充一下吧：
1、按你说的尝试过的改变，如果各种试剂没有过期，溶液又是新配置的，那就是你做胶的原因，具体配方可以参考这里：cuturl('http://www.takara.com.cn/?action=Page&Plat=detail&newsid=74&subclass=2')里的2、3部分；
2、注意一下你的SDS Loading Buffer，不要过期了或者放置过久了，这个也有关系，曾经有用过一只，同样的蛋白跑出的条带却不完全一致，后来试剂商说是放置很久了，拿来当赠品送人的；
3、注意检查电泳液的配方，刚才第1条里我写的那个网址里也有电泳液的配方，电泳液离子浓度过高或者过低会影响电流，可能会影响到电阻什么的；
4、电泳不需要降温，你用的电压也合适，不是这方面的原因~~

雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2013-10-10 10:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的是加好水后仍然有分界线，就是一条很直的折光线，一直到最后凝好都是存在的，以前都是没有的，所以这个应该是凝的过快吧？

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