【求助】急切求助二维电泳的有关问题

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标题:【求助】急切求助二维电泳的有关问题

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-10-10 14:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
肿瘤
我做的是腋下接种肺癌细胞系A549裸鼠，做的样品是正常裸鼠的心肝脾肺肾，接种一周然后处死裸鼠的心肝脾肺肾，以及接种三周后处死的裸鼠的心肝脾肺肾。我现在都研二了，之前做的图都没法看啊，很担心能否顺利毕业啊。现有几个问题向请教高手啊。
1.我做的是差异蛋白质组学，寻找肿瘤的标志物。由于样本是取的师姐的，裸鼠已经处死，这最多也值接种了三周，我怀疑肿瘤未扩散转移，因为处死时取出来的都是腋下的实体肿瘤。问相对应的各器官正常的和接种的会有差别吗？这样做下去有意义吗？

2.我的样品处理：-80度冰箱拿出于冰上恢复至室温，称重，加液氮研磨，按1：10体积比加入裂解液，倒入EP管内，冰上裂解1h，超声，低温离心，取上清分装于-80度冰箱保存备用。
请问上述步骤有哪些错误不妥之处？还要丙酮沉淀吗？可以用加样前离心代替吗？

3.下面是我做的胶图
做的是正常和接种的肺组织。
pH4-7,13cm, 总上样体积：250ul 总上样量：400ug
IEF：step1:100v,1h
grad2:200v,1h
grad3:500v,1h
grad4:1000v,1h
grad5:8000v,3h
step6:8000v,50000vhr
SDS-PAGE:2w/gel30min,17w/gel大约四小时
银染

做的很难看，不知道是怎么回事，很着急啊，请高手指教啊

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2013-10-10 14:53

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2013-10-10 14:53

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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-10-10 14:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-10-10 14:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢啊，我用的是12.5%的凝胶。用的是GE的双向电泳系统。之前怀疑是胶条有问题，因为之前做的胶条都是过期了的，这一次特地对比了下，发现两张图差不多，真是心都凉了半截，咋整的啊，就是做不出来啊，着急啊，不知道是什么原因呢？

pH4-7,18cm,上样量：200ug，样品浓度是3.76ug/ul

这张是以前的胶条做的

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2013-10-10 14:54

63853691.snap.jpg (99.69 KB)

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-10-10 14:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这张是新买的伯乐的胶条做的

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2013-10-10 14:54

34063113.snap.jpg (102.89 KB)

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-10-10 14:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

都采用的是银染，做到显色这一步时就一下子从上至下慢慢的变黑了，真是不知道怎么就变黑了，跟以前的操作一样但以前没有这样的，点很少，有一些点，但都被黑色给压住看不见了，看到这样的图真的是痛心啊，不知道怎么回事，是样品处理的原因？上样量过大过小？还是怎么回事呢？望高手不吝赐教啊

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发表于 2013-10-10 14:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

底纹太重了，建议缓冲液换新的，玻璃板洗的更干净些！

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-10-10 14:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于以上问题一一回答如下：
1，这个问题不好回答，没有做过也没有看过这方面的
2，直接裂解法是一个比较简单同时也是最能体现蛋白表达原貌的方法，但往往杂质会比较高，保险起见可以采用直接裂解后再次丙酮沉淀，然后复溶样品会得到比较好的效果，至于上样前离心，这个是必须的，不管是否用丙酮沉淀过。
3，貌似SDS-PAGE的凝胶孔径过小，大分子蛋白没有跑下来，建议采用浓度降低1%的SDS-PAGE胶，另外，有些蛋白好像有重影，不知道是否是胶条放置的问题，
欢迎其它朋友提出更有建设性的意见和建议

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我加的裂解液一般1ml左右，最多也就1.5ml，这样的话用研钵会不会浪费很多？是不是要用玻璃匀浆机？我们实验室没有没用过，什么牌子的好用啊？
有没有详细的组织提蛋白的步骤啊，谢谢指教啊

JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-10-10 14:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是新手，最近做2D，也是做不出来，蛋白点都没有，一开始以为是胶条有问题，又重新买了新胶条，结果还是没有蛋白点。都不晓得是为啥子了。

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2013-10-10 14:57

98516621.snap.jpg (35.03 KB)

JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-10-10 14:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的样本-80度冰箱保存，取出称重，50mg样本:300ul裂解液，冰上匀浆，裂解30min，低温离心40min，12000。取上清液-80度保存。

被动水化过夜：pH4-7,17cm, 总上样体积：300ul 总上样量：300ug
IEF：S1:250v,30minS2:1000v,1hS3:10000v,5hS4:10000v,60000vS5:500V,16hSDS-PAGE:10mA/gel 30min,20mA/gel 大约四小时考染和银染
各位大侠帮帮忙啊？

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2013-10-10 14:58

67261212.snap.jpg (41.89 KB)

youyou99[使用道具]
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发表于 2013-10-10 14:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该是二维电泳时上面温度太高，我也遇到这个问题，上面黑下面白，难看！

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