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标题:【求助】8M尿素和6M盐酸胍都无法溶解包涵体蛋白

ns5fan[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】8M尿素和6M盐酸胍都无法溶解包涵体蛋白


各位高手，我表达的蛋白存在于包涵体中，我想通过变性后过柱来纯化蛋白，但现在遇到一个很奇怪的问题，我的蛋白在8M的尿素和6M的盐酸胍中都无法溶解。我用8M的尿素处理包涵体，然后20000离心20分，发现上清中没有我的目的带，而沉淀我再次用8M的尿素悬浮，SDS鉴定，发现目的带很纯，只有一条很淡的杂带，纯度估计可以达到85％了。现在一个难题是，我该用什么方法溶解我的蛋白，我要做抗体用的。
谢谢各位高手指点啊！
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发表于 2013-10-10 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用尿素溶了多长时间?我用盐酸胍容的时候要 放置一个小时,还有如果放置一个小时后仍不容的话可以加dtt或者巯基乙醇,古光杆肽等等,破坏蛋白的二流键
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发表于 2013-10-10 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢您回复的帖子！
我用尿素溶解了将近2个小时，还在60的水域中放了半个多小时，但就是不容，盐酸胍也溶了差不多2个小时。我是五一时超声得到的包涵体，然后－20放了一周，然后才用尿素溶解，是不是时间太长了，才导致无法溶解呢？
谢谢高手指点！！
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发表于 2013-10-10 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个情况应该不会是蛋白不溶的原因,我觉得你可以看看你的蛋白是不是有二硫键,如果有的话加点dtt或者巯基乙醇破坏它的二级结构.
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发表于 2013-10-10 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的指点，只是我不知道怎么才能知道我的蛋白有没有二硫键啊。以下是我的蛋白氨基酸序列，如果可以麻烦您帮我看看是否有二硫键，不尽感激！
MKLLVVFAMCMLAASAGVVELSADTSNQDLEEKLYNSILTGDYDSAVRQSLEYESQGKGSIIQNVVNNLIIDKRRNTMEYCYKLWVGNGQEIVRKYFPLNFRLIMAGNYVKIIYRNYNLALKLGSTTNPSNERIAYGDGVDKHTELVSWKFITLWENNRVYFKIHNTKYNQYLKMSTTTCNCNSRDRVVYGGNSADSTREQWFFQPAKYENDVLFFIYNRQFNDALELGTIVNASGDRKAVGHDGEVAGLPDIYSWFITPF
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发表于 2013-10-10 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用盐酸胍溶的蛋白刚开始还好,放一会就沉淀了,后来干脆就用baffle A溶了.
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发表于 2013-10-10 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外你可以试试我的一个小窍门吧。
就是将你的包涵体先用8M尿素通过玻璃棒的搅拌悬浮起来，然后呢，去超声。
可以超声5s，间隔3s，超声50次左右。应该会溶了。
第一，超声比搅拌的效果要好。
第二，超声时，温度会升高，利于变性溶解。
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发表于 2013-10-10 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像尿素或者盐酸胍遇到上样缓冲液后会产生沉淀，是吗？我做了几次都这样。
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ns5fan[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很感谢您给的建议,但我按您的方法试了,还是不能完全溶解我的蛋白,仍然是悬浮液.困惑,无奈啊!
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发表于 2013-10-10 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的是昆虫脂蛋白，纯化方法独特

用磷脂，或者表面活性剂吧
给你参考文献：
1、人重组载脂蛋白E在大肠杆菌中的表达和纯化
表达载体是pet32a，产生可溶的载脂蛋白E2thioredoxin 融合蛋白
下载地址：
cuturl('http://www.shouxi.net/journal/39/2002/5_5/')人重组载脂蛋白E在大肠杆菌中的表达和纯化.pdf

2、载脂蛋白分离纯化
cuturl('http://post.baidu.com/f?kz=84794309')
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