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标题:【求助】让我郁闷一天的做胶

queen[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】让我郁闷一天的做胶

今天是做western-blot的第一天，从做分离胶和积层胶开始。但万万没有想到，做胶的过程硬生生的将我由壮志雄心打入精疲力竭的无奈之中。
10％分离胶：
ddH2O:11.8 ml
A液：10ml
B液：7.5ml
10％AP：300ul
TEMED:12ul
中午12点灌胶，到下午3点还无凝固的迹象，本欲愤然离实验室而去，后37度水浴帮我度过此关！
本以为否极泰来，下面可以顺利。继续积层胶的配置。
5％积层胶：
ddH2O:20.4ml
A液：5.1ml
C液：3.75ml
10％AP：300ul
TEMED:30ul
从3点等到现在，积层胶最上端卡梳齿之处就是无法成形。且胶水平面不断下降，大有低于梳齿之势。打开其中一块，发现积层胶靠分离胶一侧已经凝固成形，就是最后一点无法完成凝固。
各位战友，能否给分析分析！
这是western的第一步，真不敢想后续还会有什么问题！
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079777chao[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS-PAGE:10％分离胶和4％浓缩胶的配方是：
10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1 .26ml
10％SDS 100 微升 50 微升
10%AP（过硫酸胺） 50 微升 25 微升
TEMED 5 微升 5 微升
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
胶不凝的最大可能就是10%的AP了，最好是现配的，很容易过期的，配置好的胶随温度的增加凝的速度增快，介绍一种加快凝胶的方法：罐好胶后放在37度孵育箱中，二十分钟就凝了。
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queen[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 079777chao 的帖子

从比例上来看，我的AP的用量比楼上的用量还要多，为什么得到这样的结果。我的AP是昨天配的，放4度保存过夜。不解！
难道如他人所说，western真的很欺生！
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u76mp[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果AP和TEMEND都没问题的话,我感觉胶也可能是有原因的,因为有的人买的是配好的现成的胶,我感觉这种胶不让人放心,特别是国产的,所以最好还是用甲叉和丙烯酰胺自己配原胶放心.另外AP我感觉用过一周也没什么的.只要放在-20度冰箱里应该可以用一段时间的.
现在这种温度我的胶反正是凝的很快的,比冬天的快多了.
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
AP配的时候试剂就可能已经失效了
可以借用一下别人成功的AP
排除一下这个因素
AP极易吸潮 务必密封保存
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发表于 2013-10-10 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
10%AP应该于－20保存
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果确定AP没问题，把配好的胶溶液充分混匀后再灌。
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我以前也碰到过这种郁闷的事，后来使通过以下几个方面来改进的：
1 AP我用的是20%，而且是现配现用，你可以根据你所要做的胶的量确定配制AP的量。
2 确定AP的质量是好的，如果不行就得重新买。
3 适当加大TEMED的量，它主要是促凝的，对你以后步骤及结果影响不大。
4 把胶做好后，最好放在温度相对高的地方，比如说37度孵育箱等，这样可以减少胶凝的时间。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我跟你的情况一样， 我也是怎么也凝固不了，什么都重新换了也还是不行。我把10%SDS 10%AP TEMMED.都加量了，还是不行，不加量也不幸，郁闷死。
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小野花[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有可能是甲叉和丙烯酰胺时间长了,不能用了.我的开始也是,后来什么都没换,换了甲叉和丙烯酰胺就解决问题了
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