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标题:【求助】western blot湿转时，用恒压还是恒流，条件是多少？

鹿奔奔[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot湿转时，用恒压还是恒流，条件是多少？

我用的是bio-rad的western blot电泳仪，以前转膜时，用的都是恒压，70v，150min。最后也能出结果，但结果不好，在论坛上，我看大家用的都是恒流，我想知道是不是我转膜条件错了。谢谢各位大侠！
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是恒流，270mA，100min。没有失败过一次。
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发表于 2013-10-10 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用100v 100 min 也没失败过一次
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fox_79[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用稳流效果很好，不妨换换试试
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我通常用恒压，100v， 60 min，效果还可以。
转膜缓冲液最好用新配制的，加上预染MARKER吧，可以监测一下转膜的情况，具体操作大家的可能差不多，多注意一下细节问题就是了，比如说在作“三明治”的时候注意一下速度，冰块降温，根据蛋白的大小和实验室的具体情况选择不同的膜等等。
在刚开始作WB的时候摸条件是必需的，失败也是正常的，继续加油哈！
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鹿奔奔[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位大侠，我去试试恒流。
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问各位大侠，有没有做过170kd的蛋白呐，我用过250mA 2h和100v 1h均没能转成功，后来索性换成400mA转了2h倒是转到了膜上，但是转移液发热太明显，感觉外面和内部的冰浴效果不明显，不知对转膜电流和电压有没有上限啊，请高手指点下，如何才能使转膜效果更好呐。另外，不知pvdf膜一定需要甲醇活化吗，我先把它放进水里根本不能浸透的
bio-rad mini型的western blot电泳仪，操作步骤、转移液应该也没问题吧
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发表于 2013-10-10 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上：
70kd的蛋白我们都是 100v 转1.5h，你170kd至少要2h
所以我觉得是你转的时间短了。
转完后你可以考染一下你的胶，看看转的情况。

PVDF用水是浸不透的，一定要甲醇。版内搜索一下PVDF，有很多帖子的。

综上所述：你的问题主要是PVDF膜没活化，其次是转的时间不够。
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发表于 2013-10-10 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们的蛋白分子量65KD，用的是伯乐得，恒压转，100V，120min～～用了几年了，效果很好
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发表于 2013-10-10 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是恒压，湿转，bio－rad，100V2H,老是效果不好，我的蛋白58KD，我发现恒压的过程中，电流基本上都在1A以上，缓冲液都沸腾了，因为我是在跟国外的博士后后面作实验，我想换条件，但是他老不换，所以转膜一直在折腾，效果一直不好，快一个月了烦死了，天天在弄这个．以前在学校用的半干转，恒流，效果很好，到这里只有伯乐的湿转仪．晕啊，我认为还是恒流好，不知道为什么恒压１００v，电流怎么那么高，buffer boiling
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