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1，我是这样做胶的，供你参考。在分离胶聚合完全之后，先用去离子水冲净分离胶顶部未聚合的丙稀酰胺。再尽可能排去分离胶上的液体，可用吸水纸吸干。然后插入齿状梳，灌入配好的积层胶，室温30min后，积层胶就可聚合完全。之后将胶放入电泳槽中，先下槽再上槽缓慢倒入电泳buffer。接着即可拔去齿状梳，记住一定要用双手拔，两手用力均匀一致，而且动作要缓慢；如此这样，就不会出现问题；
2，封闭时间有些短，室温2h;或者4度过夜效果最佳。5％BSA的浓度已经足够，我一般只用1％，用TBST配制；背景深的原因也有很多，不过你试着降低一抗以及二抗的稀释浓度，效果会很明显；
3，做磷酸化的WB最好都要用BSA来封闭，不能用普通的脱脂奶粉，因为奶粉中也存在磷酸化的蛋白。但普通的脱脂奶粉是可以用来做非磷酸化的WB的，我见过有人用过，效果也可以；
4，既然你要用BSA来封闭，那么就不要用脱脂奶粉，两者不能互相代替。我做实验的经验是：稀释一抗、二抗用1％－5％均可，就看你自己条件摸索如何了。
祝你顺利
