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标题:【求助】一抗后漂洗时间过长会洗脱膜上抗原吗？

阿司匹林[使用道具]
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发表于 2013-10-15 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】一抗后漂洗时间过长会洗脱膜上抗原吗？

今天做Western Blot时，突然有急事处理，膜从一抗杂交袋取出后，在TBST里漂洗了近一小时，最后仅见b-actin有一个条带，目的蛋白和其它内参蛋白没有条带。

想问下漂洗时间过长除了一抗抗体外，还会洗掉膜上蛋白吗？膜再生还有必要再做吗？
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发表于 2013-10-15 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得在TBST里漂洗了近一小时应该没有问题。我平时洗膜都是10 min×4，实验室有的老师是15 min×3，哪个都是将近一小时，最后做出来的效果还好，很多都已经发了文章了，所以应该不是洗膜时间太长造成的。

仅见b-actin有一个条带，我认为可能是你的转膜出了问题。三明治没有做好，膜与胶的接触、有气泡都可能造成现在的结果。当然，提取蛋白也要仔细看看实验记录是否有需要完善的地方。

像这种很可能是问题出在转膜上面，蛋白都可能没有转到膜上，再做膜再生是想做什么？
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发表于 2013-10-15 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该问题不大，可能会洗掉结合不够牢固的反应物，但是膜上的蛋白在此缓冲体系应该不会没有。应该考虑下你试验的步骤等原因。
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发表于 2013-10-15 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
仅见b-actin有一个条带，我认为可能是你的转膜出了问题。三明治没有做好，膜与胶的接触、有气泡都可能造成现在的结果。当然，提取蛋白也要仔细看看实验记录是否有需要完善的地方。

像这种很可能是问题出在转膜上面，蛋白都可能没有转到膜上，再做膜再生是想做什么？

==================================

嗯~多谢！
膜再生想看看能不能补救一下做出蛋白条带
现在正配丽春红染染看膜上有没有蛋白。
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发表于 2013-10-15 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1。洗的时间过长对膜上蛋白影响不大，对有些抗体还是有影响的，我有过类似的经历，确实可以洗掉一部分抗体。
2。actin都做出来了，转膜明显是没问题的。
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发表于 2013-10-15 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般WB做不出大多数问题是蛋白提取、转膜、抗体三者问题，暂且抛开抗体，从结果上看，只有一个actin条带，目的蛋白和其它内参蛋白没有条带，而非楼上所说的actin都做出来了。我认为首选应该从转膜找原因。actin在细胞中是丰蛋白，蛋白提取就算不很充分也应该是比较容易做出来的，我们这边实验室的学生很少说有actin做不出来，就是这个原因。现在连actin都是仅仅出来一个带，很可能是转模时候因为某种原因胶与膜之间没有贴紧。当然，楼主并没有说清楚转膜的参数，参数也是需要考虑的。不是说其他原因就不可能，只是找原因先找最可能的。
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发表于 2013-10-15 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是不是actin在细胞的任何位置都有表达呢 谢谢
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发表于 2013-10-15 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

actin是肌动蛋白，在细胞浆中丰表达，不表达在胞核中。一般情况下，actin的表达量是相对恒定，所以常用于作为胞浆蛋白内参使用。但是不适合于作为胞核蛋白的内参
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阿司匹林[使用道具]
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发表于 2013-10-15 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般WB做不出大多数问题是蛋白提取、转膜、抗体三者问题，暂且抛开抗体，从结果上看，只有一个actin条带，目的蛋白和其它内参蛋白没有条带，而非楼上所说的actin都做出来了。我认为首选应该从转膜找原因。actin在细胞中是丰蛋白，蛋白提取就算不很充分也应该是比较容易做出来的，我们这边实验室的学生很少说有actin做不出来，就是这个原因。现在连actin都是仅仅出来一个带，很可能是转模时候因为某种原因胶与膜之间没有贴紧。当然，楼主并没有说清楚转膜的参数，参数也是需要考虑的。不是说其他原因就不可能，只是找原因先找最可能的。

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嗯，重新做了膜再生后，发现目的蛋白条带都出来了。。。
可是、、可是、、beta-actin连之前的那一个可怜的条带都没有了。。。
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阿司匹林[使用道具]
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发表于 2013-10-15 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

嗯，转膜是湿转；稳流45mA，电压约40V左右2小时；PVDF膜4层滤纸；BIORAD转膜槽。
自我检讨actin膜再生没见条带可能与用了上次一抗杂交袋有关
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