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标题:【求助】研究膜蛋白的朋友

avi317[使用道具]
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发表于 2013-10-17 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】研究膜蛋白的朋友

偶要做膜蛋白方面的试验，万事开头难。
有做过这方面研究的朋友，说说心得？
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-10-17 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先是膜蛋白的置备，这个过程是成功的关键性因素之一。膜蛋白的置备通常用的是 ：
1．透析和超过滤 透析和超过滤是生物化学实验宰分离蛋白质常用的一种方法。它是利用蛋白质分子大小能透过半透膜的性质设计的，使蛋白质和其他小分子物质无机盐单糖等分开。透析用的半透膜(即透析袋)和超滤器所用的半远膜都有不同型号和规格，根据所分离的蛋白质分子大小来选择好半透膜，用前要经过处理，去除重金届，蛋白水解酶，核酸酶等污染。处理的办法是用o、5加以Ef)fA煮30加n，弃占溶液，用水漂洗，浸在所用的缓冲溶液中。透析是将待提纯的蛋白质溶液装在透析袋中，然后把透析袋放在极0
的透析缓冲液中，透析外液间隔数小时可以更换，为提高透析效率，透析外液可加搅拌，至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小位 超过滤与透析的原理是相同的。只是更适用于大量分离：把提取的蛋白混合液装入具半透析膜的超过滤器或离心管中，利用加压或离心力，强行使小分子物质或水通过半透膜大分子蛋白质不能通过膜留在膜上，起到纯化和浓缩的作用。
2．密度梯度离心 由于蛋白质分子大小不同，它的密度和质量也不同。当把蛋白质合物的溶液加到具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的蛋白质比质量和密度小的蛋白沉降得快。当每种蛋白质沉降到与本身密度相等的介质梯度时，控制离心速度和离心问，最后蛋白质各组分停留心各自的密度层，被分离或各自独立的蛋白区带。可用针头分收集各成分。常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚庶糖梯度。蔗糖价格便宜，纯度高。聚庶糖商品名是FiLlll．分子量约为400．000。需要高密度和低渗透压的梯度时，可用FiDll代害
蔗糖。在实际操作密度梯度的配制时，要严格配制备浓度梯度。加入到离心管内的各梯度至十分小心，管底密度最大，向上逐渐减少，最后加入待分离的蛋白溶液。离心一定选用水平转头进行。

我做的是AT1受体，如果可能大家互相讨论啊
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发表于 2013-10-17 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想做白三烯受体，是一种GPCR家族的膜蛋白。第一步是从皮肤组织中拿到它，应该怎么做啊？我还想保持它的构想不发生改变，有什么办法吗？请各位大虾指点！
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发表于 2013-10-17 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么一定要用水平转头呢？
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-10-17 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 avi317 于 2013-10-17 12:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

为什么一定要用水平转头呢？

密度梯度离心时,使用水平转头可以确保各组分均匀的分布在相邻梯度的界面处,易于收集. 若使用角转头或垂直转头,离心完后各组分贴在离心管壁上,难以收集.
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发表于 2013-10-17 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

参考一下 【膜蛋白相关贴索引】
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-10-17 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可是我刚刚用的垂直转头做蔗糖密度梯度离心，没发现贴在离心管壁上，收集也不困难。
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-10-17 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一个由多个疏水蛋白组成的超级膜蛋白复合体，我想把它增溶后做SDSPAGE，可是总是有的蛋白跑不出来带。感觉是有分子量很大的聚集体在分离胶里泳不动呀！
我用的通常做SDSPAGE普通用的样品缓冲液，有SDS，巯基乙醇，甘油，溴芬兰等。
是不是要加大增溶的力度？
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-10-17 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问有没有高手表达过病毒的膜蛋白（含跨膜区的）啊，能否给点建议。做胞内表达还是分泌好，是否有成功的例子？
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-10-17 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么一定要用水平转头呢？

密度梯度离心时,使用水平转头可以确保各组分均匀的分布在相邻梯度的界面处,易于收集. 若使用角转头或垂直转头,离心完后各组分贴在离心管壁上,难以收集.

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我们实验室只有角转头，能否使用它做密度梯度离心啊，是否如你所说的那样很难收集啊。还有你们的水平转头能达到多大的转速？
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