【求助】70KD蛋白转膜用多大电压？

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标题:【求助】70KD蛋白转膜用多大电压？

xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-10-17 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位，最近在做一个170KD左右的蛋白，不知道转膜时湿转用多大电压多长时间？做过一次用100V,1.5h感觉效果不是很好，麻烦各位给个意见，多谢！！！

49888[使用道具]
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发表于 2013-10-17 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我平常做蛋白分子量差不多，大约150左右，我通常用200mA 3小时

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发表于 2013-10-17 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

转膜时是调电流，分子量大，可以低电流长时间，我采用的一般是100mA, 4度过夜，转时注意一下电压，100mA时，电压一般才50-70V的样子，太低了不行，可能转移液有问题。

987789[使用道具]
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发表于 2013-10-17 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、电泳的胶的浓度不要太大，一般8%或10%，甚至可以6%。
2、在湿转的转膜缓冲液中不要添加甲醇
3、恒流转，电流可以调到300-350mA，适当加冰冷却，转膜时间2个小时左右就可以了
以前我转过200多KD以上的都没有问题

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发表于 2013-10-17 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得如果不是为了分析多个分子量相似的蛋白之间的差别，只要坐一个蛋白的western的话，其实分离胶浓度不是那么要紧的事情。因为无论多少浓度，170kd的样品肯定都能和内参分得很开的。
6%的胶太软了，操作上不是很方便，很容易弄破。

请教一下，为什么你觉得不加甲醇好呢？

987789[使用道具]
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发表于 2013-10-17 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

转膜缓冲液中加入甲醇往往使分子量较大的蛋白不容易贴膜，所以我们做大蛋白的时候通常不加

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发表于 2013-10-17 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哦，那通常甲醇的作用是什么呢？
另外，通常做western还需要内参，像GAPDH只有三十多K，如果不加甲醇的话，可能内参方面就会受到影响了吧？

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转膜缓冲液中加入甲醇往往使分子量较大的蛋白不容易贴膜，所以我们做大蛋白的时候通常不加

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发表于 2013-10-17 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

电压和电流试根据面积确定的

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发表于 2013-10-17 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也要做一个180-190KD的蛋白的WESTERN呢。做这么大分子量的蛋白，用什么内参呢？actine的分子量才45吧，等180KD的蛋白跑开，actine是不是该跑到较外面去了啊？

JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-10-17 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、电泳的胶的浓度不要太大，一般8%或10%，甚至可以6%。
2、在湿转的转膜缓冲液中不要添加甲醇
3、恒流转，电流可以调到300-350mA，适当加冰冷却，转膜时间2个小时左右就可以了
以前我转过200多KD以上的都没有问题

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我要做一个180-190KD的蛋白，这样大的分子量，对PVEF膜的孔径有没有要求？这么大分子量用什么做内参呢？

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