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标题:【讨论帖】成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ...

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ...


成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ做不出来是那部分出问题了．看看各部分出问题的几率，为还没有成功，仍然苦苦寻找结果的战友提供点参考（由于本人经验有限，不足之处还请斑竹和各位大侠改正）：

1、蛋白提取问题，蛋白降解，或者上样量少导致检测失败。
2、蛋白电泳失败。
3、转膜问题：转膜不充分，过转，温度过高导致蛋白结构改变等。
4、抗体问题。
5、显影问题。
6、其它。
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发表于 2013-10-17 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
抗体问题排在第一，抗体的特异性，一抗二抗的比例，这些都需要摸索条件。
蛋白电泳第二，胶的配置，由于APS的失效，tris-Hcl PH不准，丙烯酰胺的氧化（以上问题一般都是配置时间较久以后）导致电泳失败或泳道奇形怪状。
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发表于 2013-10-17 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我认为western bloting 中蛋白提取是关键，最好用试剂盒提取，尤其目的蛋白是在亚细胞器表达的蛋白；其次是一抗二抗，一抗最好单克隆抗体，二抗国产好厂家的也行 ；ECL发光试剂一定要灵敏；制胶，电泳和转膜个实验室都做得比较常规了；显影定影按说明书作做活实验是经验就行。
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。

另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。

最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我以前做的时候问题主要出现在样品的制备上，也就是如果免疫时用到的蛋白和wb时的蛋白有出入，这样就会导致wb失败，所以后来我就一次性制备足够的蛋白，可以不是很纯，但是一定要和免疫动物时候用的蛋白是同一批的。
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发表于 2013-10-17 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看到好几位战友都对蛋白制备有深刻的印象，也提醒我们正在WESTERN和准备WESTERN的战友，一定要注意过第一关，提出高质量的蛋白对实验成功至关重要！
希望更多的战友参与！
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ha111[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上几位战友提出的蛋白制备确实非常重要，但如果在裂解液中加入cocktail的话应该不容易降解，-80度保存几个月都没有问题。
我认为western blotting 中最关键的一步是转膜。我的经验是小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD）以上建议湿转。具体转膜条件需要多摸一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。
抗体一般在其他问题排除后再考虑是否有质量问题。
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一下各位高手，我做WB时，总是内参能出来（有时条带不太完整），目的蛋白老是出不来可能是什么地方出问题？（蛋白应该没问题，同样的蛋白已经做出来几个指标了。）

还有我转膜时一次转好几张，有的出来，有的出不来可能是什么原因？

谢谢了！
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nut6694[使用道具]
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 小中大
请教一下各位高手，我做WB时，总是内参能出来（有时条带不太完整），目的蛋白老是出不来可能是什么地方出问题？（蛋白应该没问题，同样的蛋白已经做出来几个指标了。）

还有我转膜时一次转好几张，有的出来，有的出不来可能是什么原因？

谢谢了！

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战友，内参一般比较好做，能出来说明整个WB的流程应该没有问题，提的蛋白也可以，但是目的蛋白由于分子量大小不一样可能电泳和转膜条件也不一样，还有蛋白丰度问题导致蛋白量低出检测范围、抗体等环节都应该考虑。具体的问题可以把你详细的条件另辟新贴求助，祝出结果！谢谢！
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发表于 2013-10-17 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细节地方一定要多注意，比如SDS－PAGE时的缓冲液pH值啊，temed、ap的新鲜程度啊，样品上样前的处理啊，还有转膜时的电压/电流、膜的处理，还有ECL时的抗体孵育时的时间与温度，显影/定影啊等等。其实一般出问题很多时候都是由于在细节地方的疏忽造成的。
希望高手继续补充细节内容：）
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