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标题:【求助】细胞核的破裂方法

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发表于 2013-10-22 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】细胞核的破裂方法


真核表达，荧光检测效果很好，可见该蛋白为核定位。收集表达该蛋白的细胞用于WESTERN BLOTTING，如此处理：PBS洗1次，100ul PBS溶解，加入100ul 2*SDS电泳缓冲液，煮沸10MIN，跑PAGE，WESTERN。
请问这种方法可以破裂细胞核，并使细胞核的蛋白质释放吗？
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tuomu45[使用道具]
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发表于 2013-10-22 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS是较强的离子去污剂,在提取细胞或病毒等核酸时常使用SDS和蛋白酶K共同作用,蛋白酶主要是降解核蛋白使核酸得以释放,所以要获得核蛋白就不能使用蛋白酶,故我个人认为使用上述方法应该能破裂细胞核,但能否释放核蛋白我不好肯定,先做实验验证一下最好,如不能看是否考虑加DNA酶处理,以使核酸降解,让核蛋白释放出来.
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发表于 2013-10-22 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主的方法可以破裂细胞核,释放核蛋白.
我们在作蛋白核质定位前,首先要确定细胞中是否存在该蛋白,就是用楼主的方法.之后再做核质分离,有些定位在质,有些在核,有些都有.如果该蛋白只定位在核,若用楼主的方法无法释放核蛋白的话,我们最初是无法检测到细胞中该蛋白的存在的.但每次我们都能得到相应的结果,说明此方法能够释放核蛋白.
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owanaka[使用道具]
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发表于 2013-10-22 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

偶是取人的肝癌组织做RT-PCR和WESTERN BLOT，标本是在离体后30分钟内放入液氮的，由于极不方便，故未用PBS清洗，结果发现RNA可顺利提出，而蛋白提取后，测OD值在260.280均为0（重复三次均如此)，其中一管跑胶，考马斯亮兰染色见少许蛋白条带，而绝大部分是从上到下的条带，不知是否蛋白已降解，是否蛋白 比RNA更易降解，收标本应在多长时间内取，不用PBS清洗会影响提取吗？
我提的是膜蛋白
RIPA裂解液：
50mM Tris-cl
1%NP40
0.5去氧胆酸钠
0.1%SDS
1mMEDTA
用时加入SIGMA的蛋白酶抑制剂（20ul/ml)
请各位高手看看，提点建议吧，不胜感激！！！
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-10-22 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是用如上的RIPAbuffer裂解组织，19000g离心15min后，取上清，请问上清是总蛋白（包括核蛋白和胞浆蛋白）么？该RIPA buffer能否破碎核膜，从而提出核蛋白呢 ？
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-10-22 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前面经过密度梯度离心核差速离心后得到细胞核，细胞核一般比较难破裂，我们用的是液氮研磨的方法，效果不错。双向鉴定出数百蛋白，我实验过超声等方法，效果要差很多。如有细节不明白，请再发贴讨论。
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-10-22 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于四楼的问题，首先你提取蛋白后，测OD的结果显示蛋白浓度很低，说明你前面提取蛋白的操作有问题。rt-pcr对RNA的要求量较低，可以扩出来。蛋白较易降解，但半小时应该不会那么严重，整块胶都是smear可能是不溶的东西表面活性剂有影响。采完样本后，放4度半小时，而后放液氮应该影响不大。
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发表于 2013-10-22 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

半个小时对细胞释放的蛋白酶来讲已经足够长了，室温即使几分钟，蛋白就会有强烈的降解。也就是说细胞或组织内翻译的蛋白酶活力很强。

液氮研磨的方法应该不会破坏细胞核膜。

因为所有蛋白都是在细胞质里翻译的，所以如果精确度足够的话，应该在细胞质和细胞核里都找到核蛋白的表达。

加上样缓冲液得到的是全细胞裂解液，核膜应该已经被破坏了。
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-10-22 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得楼上的说法并不太对，我们精提的细胞核首先要通过研磨破碎，这不是我们的首创，这也是比较经典的方法。而且配合后面的试验步骤，我们试验的结果还是不错的。如果象楼上说的，直接研究细胞质蛋白就可以弄明白核蛋白组成了，另外我们还做电镜比较了破碎前后核的变化。
另外不同的蛋白对蛋白酶的耐受是不同的。有的重组蛋白4度放置半年也不会降解（我研究的蛋白之一），有的蛋白如你说的那样，特别敏感。这都是极端的例子，不具有普遍性。
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发表于 2013-10-22 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用液氮研磨的目的并不是为了提细胞核，对于组织里细胞质蛋白的提法，同样应该用液氮精磨，也就是说磨的目的是为了让细胞细胞更好的分散而不粘连，不是把细胞膜磨碎。

至于蛋白酶对蛋白降解的极端例子，不想多说，事实中存在多少，只有实验了才知道。
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