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标题:【求助】如何制备ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳的菌液上...

阿k[使用道具]
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发表于 2013-10-22 19:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如何制备ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳的菌液上...


原核表达完成以后，想利用SDS-PAGE进行融合蛋白的溶性实验分析，可是制备的上清样电泳染色后，效果很不好，条带很淡根本无法拍照。我使用的反复冻融的方法进行的裂解（没有超声波仪），4000rpm,10min收集菌体，加入５０ulddH2O，在加入4*SDS样缓热裂解５min.
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2013-10-22 19:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也用反复冻融的方法进行的裂解，具体如下：
1.反复冻融后离心：12500转，30分钟。
2.分出上清和沉淀。
3.取上清20ul，加2xsds上样缓冲液20ul，混匀。
4. 沸水煮3-5分钟。
5.上样20-40ul。

我是这样做的，效果还行，仅供参考。
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2013-10-22 19:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外你的染液是不是时间太长了，必要时更换。
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-10-22 19:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我以前也是用煮沸法裂解的,不过我是用PBS悬浮菌体,再加入裂解液,混匀后煮沸5min,离心取上清10uLSDS-PAGE电泳.效果很好,而且很容易做的.
也建议你染液重新配过.
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-10-22 19:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

条带颜色很浅,可能的原因:
1. 上样量太小, 要有一定的菌液量,染色才能好.如OD600为8.0,可以用100ul上样.
2. 染液中SDS量太多了,影响染色. 染液重复用2次,就尽可能的换新的;
如果是大肠杆菌的话,裂解的方法并不重要,我只是按正常的方法煮5分钟,就可以了,没有出现过问题.
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发表于 2013-10-22 19:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的也是大肠杆菌啊！可是我已经加样到了100ul,还是不行啊！是不是我反复冻融的次数不够呢？染液是刚配的应该没有问题的。另外，你们的大肠杆菌一般到多少OD的时候诱导表达呢？
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发表于 2013-10-22 19:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
菌量多少才合适呢？我的全菌样的条带已经很浓了啊！在加大可能就要连一起了，所以，问题可能还在裂解那一步了。
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hold住[使用道具]
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发表于 2013-10-22 19:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果全菌样的条带已经很浓了，那么裂解的出问题的可能性就比较大了
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-10-22 19:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我以前也是用煮沸法裂解的,不过我是用PBS悬浮菌体,再加入裂解液,混匀后煮沸5min,离心取上清10uLSDS-PAGE电泳.效果很好,而且很容易做的.
也建议你染液重新配过.

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似乎这是全菌蛋白的电泳？
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阿k[使用道具]
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发表于 2013-10-22 19:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是大胶的垂直板电泳。
小军医 ：
如果全菌样的条带已经很浓了，那么裂解的出问题的可能性就比较大了
那么，应该如何做呢？
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