【求助】目的蛋白没挂上镍柱

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标题:【求助】目的蛋白没挂上镍柱

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

bling[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

binding buffer中含有少量咪唑是为了减少杂蛋白与镍柱的结合，可以保留10-20mM咪唑，最终的洗脱液中咪唑含量可适当增加，我用到250-500mM。试试看吧，祝你好运！

u234[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 你的镍柱是哪个公司哪个型号的?是不是每次用之前都重新挂的镍？上样量和镍柱体积是否符合比例？
2. 你binding buffer记上样的PH值多少？
3。我所做的蛋白在可溶和变性条件下洗脱的咪唑浓度有很大不同，可溶状态下需要更高的咪唑浓度，0.5M，不知道你这个需要多少，可以试一下
4、挂完柱和洗脱完以后可以取一点填料煮了跑电泳，看看你的蛋白是否在上面？

蛋白纯化是一个漫长辛苦的过程，祝好运！

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1. GE的HisTrap，预装的，没有重新挂，clean完之后在20%乙醇保存。
2. 我裂解液的pH是7.8，然后跟另外一种buffer（pH 8）混合，形成20mM咪唑的溶液上样的
3. 我的蛋白是要保持活性的，我这个有文献报道过了
4. 填料？我们这个是装好的柱子，不可以拆的

哎

zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

标签被包埋，可以尝试更换标签的位置或者在变性条件下上柱。

greenbee[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 zhenxin 于 2013-10-25 21:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

标签被包埋，可以尝试更换标签的位置或者在变性条件下上柱。

什么意思，做蛋白做了一个多月，很多知识都不知道

greenbee[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不挂柱的现象很常见，首先应该试试不加咪唑。这种情况最好不要用预装柱，随便找家公司买点His介质自己做个小柱子，SDS-PAGE的时候把上样液，流出液和一点His柱介质都上样看看是不是挂柱。
如果His介质SDS-PAGE没有蛋白，证明确实不挂柱。你可以试试在蛋白里加4M尿素看变性条件下是否挂柱。
如果变性条件还不挂柱可以试试做个亚克隆，把His tag换个地方。这个要小心一点，根据你的目的换地方，一般在N末端和C末端之间互换。
如果还不行，可以换个大点的标签，比如GST一类的，当然这要根据你的目的。也可以采取常规方法纯化蛋白，一般就是硫酸铵沉淀，离子交换，疏水柱，凝胶过滤一类的，其实这些方法都比较容易，自己找些资料看看，多试试就会了。

ALALA[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我所表达的蛋白是43kd，在酵母中表达的，用玻璃珠破碎细胞壁后用镍柱纯化

但跑SDS—PAGE检测，发现穿透液所含有的目的蛋白跟之前保存的裂解液的蛋白含量差不多，而洗出来的虽然也有我要的蛋白，但含量很低。

我用的binding buffer是含有20mM咪唑的。然后梯度洗脱，用30-120mM咪唑洗脱。

我老板叫我binding buffer不要加咪唑，直接上样

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请问是不是该这么做，还是其他地方有问题。做了1个月，很烦
不知道楼主解决了蛋白挂柱问题没有，最近本人也在纯化酵母体内的蛋白，我用的是50mM Tris的缓冲液，我也是遇到了像你一样问题，感觉蛋白没有挂上柱啊，今天试了一下上样溶液中不加20mM咪唑的，但是跑胶感觉还是没挂上柱，Ni柱我是刚刚再生的，愁死了，不知道问题在哪里啊。。。

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

使用组氨酸标签表达蛋白，但是不挂镍柱这种情况也算比较常见了，导致不挂柱的原因有二。原因之一是有时候由于组氨酸标签被包裹在蛋白结构内部导致目的蛋白不能挂柱，验证方法是给样品里加上尿素或盐酸胍变性，然后再变性条件纯化，看目的物是否能挂柱。如果还不能挂镍柱，就需要考虑是组氨酸标签表达问题了，需要先做一个weatern blot，用组氨酸的抗体检测组氨酸是否被表达，挑到突变株为表达组氨酸标签也会发生目的物不挂住的情况，这样也比较麻烦，需要重新构建克隆。

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发表于 2013-10-25 21:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、建议重新挂镍，如果是新的预装柱可以不用。
2、结合一下你蛋白的等电点，然后选择上样buffer的PH值，最后有2-2.5的间隔，同时裂解以后重新调PH值，一般裂解以后都会改变的
3、上样buffer里可以不加20mM的咪唑，用20mM的咪唑洗脱杂蛋白，然后0.5M洗脱目标蛋白

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0.5M洗脱目标蛋白？是不是有点高呢？文献报道在100uM之内就能把目的蛋白洗脱下来了。

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