【求助】心脏组织蛋白GAPDH内参一直不齐~

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标题:【求助】心脏组织蛋白GAPDH内参一直不齐~

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小僧一年中一直在做心脏蛋白方面分子实验，方法是Western Blot，遇到的最大问题是内参不齐。向各位大侠求救！

蛋白提取方式是：直接在深麻醉状态剪下心脏，不取血不灌流，PBS中漂洗余血，以最快速度取其中一块，液氮速冻后-80℃保存（全过程3分钟），保存时间从3个月到半年不等。

lysis buffer用前加入PMSF和PPi，以每20mg：500μl 裂解液的比例进行玻璃匀浆器手动冰上匀浆。然后3-3-3超声裂解，冰上静置半小时后，12,000*rpm 10分钟，取上清。

由于灌注的是缺血缺氧对心肌蛋白的影响，而且要做染色关注冠脉，所以一开始没有灌流的步骤，怕有影响。所以到此步发现上清深浅不等，有的偏红，有的色浅。

随后BCA蛋白定量，蛋白浓度好，在标准曲线量程内，曲线R2>0.99

然后混样变性，上样量根据实验目的不同，从30μg到150μg均尝试过。内参选择GAPDH，因为心肌无法使用骨架蛋白作为内参，但GAPDH始终不齐。

至此，有以下几个问题：

1、不灌流是否真的有必要？

2、含血的组织进行BCA定量，得到的结果受血红蛋白的“红色”影响吗？

3、红细胞中有GAPDH吗？红细胞也是以GAPDH作内参吗？是否含血量不同的时候，GAPDH就失去了内参意义？

The end。希望大家多多指教！！！

暗香涌[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也做过心肌组织的蛋白，没灌流，就用PBS冲洗了下，上清液也有黄红色出现，BCA定量很齐，你的不齐会不会是loading的体积没有加上或蛋白降解也有可能的，最好免疫印迹前定量，转膜或显影不齐后有没有适当自己调整上样量，有时我定量后也不太齐就自己调整下体积。
再就是你蛋白检测的方法是哪种，ECL孵育完全与否及X胶片压片的时间长短也会直接影响条带的粗细的。

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 暗香涌 于 2013-10-25 21:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我也做过心肌组织的蛋白，没灌流，就用PBS冲洗了下，上清液也有黄红色出现，BCA定量很齐，你的不齐会不会是loading的体积没有加上或蛋白降解也有可能的，最好免疫印迹前定量，转膜或显影不齐后有没有适当自己调整上样量，有时我定量 ...

谢谢你的分享！

我是这样操作的：定量后混好5*loading buffer和1*loading，混匀离心至管底，然后95度变性5-6分钟，再用离心机甩一下，-20摄氏度保存过夜，第二天待溶解后混匀离心至管底，全部上样，就算是加飞出去，也基本是枪第二档的1-2μl。

现在总是不齐，总是需要跑一次后再根据内参调整体积；可最近发现如果血红蛋白中不含GAPDH，那么含血量不同的组织就应该GAPDH不齐，我就不知道该不该调整内参了……

检测是ECL孵育，混合A/B液后我会孵育1-2分钟再压片，压片时间根据亮度而定，一般都会压30分钟到1小时，因为很少有肉眼可见的亮度。

uuooii[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

至此，有以下几个问题：
1、不灌流是否真的有必要？
2、含血的组织进行BCA定量，得到的结果受血红蛋白的“红色”影响吗？
3、红细胞中有GAPDH吗？红细胞也是以GAPDH作内参吗？是否含血量不同的时候，GAPDH就失去了内参意义？

==============================================================================================================

1、个人认为最好还是灌流，虽然做的是缺血缺氧模型，但在取材的时候应该来说这个模型是已经做成了的，或者说已经有改变了的，灌流不是完整的灌流固定的操作，只需要用20-50ml生理盐水迅速地把血冲出来即可，过程很快；
2、含血的组织进行BCA定量，应该来说是会受影响，一是因为里面有血红蛋白，也是一种蛋白；二来血红蛋白还有颜色，而无论哪种方法测定浓度的时候都是靠吸光度来测定OD值的，可能因为是所有的样品都含有血，所以在定量的时候这种差别被隐藏掉了；
3、GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。红细胞的供能方式主要之一就是无氧糖酵解，应该说也会含有GAPDH，是否失去了内参意义，这个可能还需要进一步查文献(我个人不是做这方面的，所以不能肯定地回答你)；
4、如果内参没有选择错误，而只是内参不齐的话，那说明你的蛋白定量有问题，只需要根据内参的IOD做一下上样量的调整就可以了。

梦幻苹果[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

灌注缺血缺氧模型不能用GAPDH做内参，换一个吧，β-actin，或者tubulin

uuooii[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2013-10-25 21:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、个人认为最好还是灌流，虽然做的是缺血缺氧模型，但在取材的时候应该来说这个模型是已经做成了的，或者说已经有改变了的，灌流不是完整的灌流固定的操作，只需要用20-50ml生理盐水迅速地把血冲出来即可，过程很快；
2、含血的组织进行BCA定量，应该来说是会受影响，一是因为里面有血红蛋白，也是一种蛋白；二来血红蛋白还有颜色，而无论哪种方法测定浓度的时候都是靠吸光度来测定OD值的，可能因为是所有的样品都含有血，所以在定量的时候这种差别被隐藏掉了；
3、GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。红细胞的供能方式主要之一就是无氧糖酵解，应该说也会含有GAPDH，是否失去了内参意义，这个可能还需要进一步查文献(我个人不是做这方面的，所以不能肯定地回答你)；
4、如果内参没有选择错误，而只是内参不齐的话，那说明你的蛋白定量有问题，只需要根据内参的IOD做一下上样量的调整就可以了。

=========================

非常感谢你的回复！！！！

好的，我会首先调整上样量。

uuooii[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 prettygirl@ 于 2013-10-25 21:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、个人认为最好还是灌流，虽然做的是缺血缺氧模型，但在取材的时候应该来说这个模型是已经做成了的，或者说已经有改变了的，灌流不是完整的灌流固定的操作，只需要用20-50ml生理盐水迅速地把血冲出来即可，过程很快；
2、含血的组 ...

首先要确保你的内参选择没错，否则都是无用功的~~

惊醒ing[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

因为缺血缺氧会导致GAPDH表达不稳定，在某些特定的细胞中表达会增高，不同的实验条件以及不同的组织要选择不一样的内参

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对，楼上倒提醒了我一下，如我前面回答的“GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶”，缺血缺氧肯定会影响糖酵解，那就会影响到GAPDH，可能真的不适合，慎重考虑~~
这个版块有关于内参选择的话题，搜索一下，好好看看，或者再查查类似的文献~~

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这……可文献里做I/R的都是用GAPDH作内参的。其实我也很犹豫这个选择，但心肌几乎从来不用actin和tubulin作内参，因为心脏状态肯定影响骨架蛋白。至于其它内参我就不知道了。。。

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