【求助】关于加蛋白裂解液的问题！

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标题:【求助】关于加蛋白裂解液的问题！

人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友，想问一下做westernblot之前，我裂解蛋白，蛋白裂解液加多少增么算啊，我查了资料有的说是按照细胞渣量加等体积的裂解液，有些又说是每50~100ul PCV 加入5 倍体积的蛋白裂解液（250~500ul）(106 cells ≈ 20ul PCV,107 cells ≈ 100 ul PCV)。到底是怎样加啊，并且细胞渣体积怎样估计的！请大虾们指教！

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前一阵子也竟然听到有人这么说：A、B因素处理的细胞或者组织块，在提取蛋白做WB之前一定要将细胞数调成一致，组织块的话就修成大小一致，且要称重要以保证相同重量，否则就会又多了一个变量因素……很奇怪，那还要蛋白定量和内参干嘛用？

人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们的处理都是转染反义质粒或者正义质粒，待转然后72小时收细胞渣，然后裂解蛋白，我们实验室采用的是加与细胞渣量等体积的裂解液。不知各位所在的实验室是不是也是72小时后收细胞渣，这个有没有特别的要求啊？要观察细胞量吗？如果观察的话细胞要达到多少呢？比如80-90%？加裂解液你们也是加与细胞渣等体积的量吗？

niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以看看一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒的说明书

zzzz[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个其实在很大程度上取决于经验。比如同样是收取35mm的细胞培养皿的细胞，由于细胞生长状态或者细胞种类差异导致最终细胞收取的pellet差异很大。如果是细胞用于跑western，通常是35mm，60mm，100mm三个规格的培养皿进行收取，我们的经验是推荐的加入量分别为50ul，200ul和500ul，不过一般60mm和100mm的皿直接收取跑western的几率不大，多为35mm，所以50ul较多，我们使用的多为hek293等工程细胞，不过如果你细胞比较大，推荐少加点，30ul也可以。

人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上战友的经验，呵呵，我们是用孔板种的细胞，也可以借鉴借鉴。

linlinstar[使用道具]
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发表于 2013-10-25 21:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个没有定量。一般来讲，一个六孔板的一个孔为例，细胞长满的话，加300-500ul均可。
大体上，加太少了溶解不了，加太多蛋白浓度过低。还要根据目的蛋白的丰度适量调整。