【求助】蛋白的斑点杂交能像WERTERN BLOT一样检...

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标题:【求助】蛋白的斑点杂交能像WERTERN BLOT一样检...

nikun230[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近在做蛋白表达，一直做免疫印迹都没有显色反应，而我用的对照确有显色带。同时我用蛋白斑点杂交来操作，可见我的蛋白样品和对照的同样有显色斑点，为什么WESTERN BLOT确得不到这样的结果呢，我直接用蛋白的斑点杂交能说明问题不？会不会是我免疫印迹操作有问题，可能出在哪呢，很是苦恼，望高手来指导指导，谢谢了

zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白的斑点杂交有结果只能说明你的蛋白里含有和对照相同的蛋白，但是由于没有经过电泳的分离，说服力没有那么强；
应该是你的免疫印迹有问题，从电泳到转膜再到封闭，以及一抗、二抗的孵育，一步步扎实排查，应该能得出结果的~~

大海啊故乡[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 zhihui小新 于 2013-10-25 22:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
蛋白的斑点杂交有结果只能说明你的蛋白里含有和对照相同的蛋白，但是由于没有经过电泳的分离，说服力没有那么强；
应该是你的免疫印迹有问题，从电泳到转膜再到封闭，以及一抗、二抗的孵育，一步步扎实排查，应该能得出结果的~~ ...

嗯是啊我的分子量大概是40KD 转膜时用的伯乐的半干转运15V25min的条件而我对照做免疫印迹还是有条带不过不是成一条条的带而是杂带的形态因为我用的一抗是多抗对照就是相应的有很多带的吧我就是有点不知道怎么排查了按理是有转膜过去的封闭一抗二抗应该都是按正常程序来的感觉好难做出来啊

zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你的对照是生物对照的话，我很怀疑你的目的样本中没有这个蛋白表达。如果你用的是实验对照的话，有可能你的目的样本蛋白的表达在胶上不是在预想的分子量上，这是可能的，而且这个应该是有意思的现象。
不要总是纠结在是否实验出问题了，从你的描述中，40KD应该不难转膜，你的对照出现了显色条带。所以，应该考虑这个现象背后的生物意义。

nikun230[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先保证电泳跑的可以，如果电泳条带就跑的歪歪扭扭，那后面转膜注定也好不到哪里去；其次转膜之后可用丽春红染一下，看看转膜的情况~~
因为蛋白的斑点杂交是直接把蛋白滴在膜上的，所以这里面已经保证了膜上肯定有目的蛋白了，而电泳之后再转膜则不同，也可能你的上样量蛋白经过电泳分离之后目的蛋白极少量了，也许是你转膜有问题，压根就没转过去，那岂能会有结果~~

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非常感谢你的回复，我跑完电泳后，有一半转膜一半用卡玛斯亮蓝染色，从染色的程度看胶跑得挺好的，我转膜后又染了转完的胶，只有一部分大分子的蛋白没有全转过去的。而我不解的是我的对照蛋白确有显色，其分子量大小些分散，按理是转过来了，可是却在杂交蛋白时有同样的结果。

nikun230[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你的对照是生物对照的话，我很怀疑你的目的样本中没有这个蛋白表达。如果你用的是实验对照的话，有可能你的目的样本蛋白的表达在胶上不是在预想的分子量上，这是可能的，而且这个应该是有意思的现象。

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不要总是纠结在是否实验出问题了，从你的描述中，40KD应该不难转膜，你的对照出现了显色条带。所以，应该考虑这个现象背后的生物意义。
你好，谢谢你的回复。生物对照和实验对照区别是什么呢？不是很清楚这个概念，我的对照是直接提取的我构建的用来表达该抗原基因的菌全蛋白，一抗是相应的血清。这个背后的生物意义该从哪方面考虑呢？思路不是很清晰，望高手再指点指点，不甚感激！！

zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢你的回复，我跑完电泳后，有一半转膜一半用卡玛斯亮蓝染色，从染色的程度看胶跑得挺好的，我转膜后又染了转完的胶，只有一部分大分子的蛋白没有全转过去的。而我不解的是我的对照蛋白确有显色，其分子量大小些分散，按理是转过来了，可是却在杂交蛋白时有同样的结果。

==============================================================

1、转完膜的胶可以用银染来试试，同时检测是否有转到膜上，后者为关键；
2、确认转膜没问题，则检查抗体以及孵育条件~~

nikun230[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 zhihui小新 于 2013-10-25 22:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常感谢你的回复，我跑完电泳后，有一半转膜一半用卡玛斯亮蓝染色，从染色的程度看胶跑得挺好的，我转膜后又染了转完的胶，只有一部分大分子的蛋白没有全转过去的。而我不解的是我的对照蛋白确有显色，其分子量大小些分散，按理 ...

谢谢啦我们实验室没有银染的材料我转完的胶用考马斯亮蓝染色了基本上都有转过去了
我想转膜应该是排除了，可能还是得从抗体及孵育条件来查，可是感觉无从查起了。因为主要是对照已经显色了，最起码一抗二抗到显色是没有问题的

王小主[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有点晕，无目的蛋白质的工程菌蛋白印迹会有条带？do you really mean it？如果真是这样，1、可能目的蛋白质没表达；2、你的一抗有问题。

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