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标题:【求助】磁珠与抗体的偶联

wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】磁珠与抗体的偶联

本人目前正在摸索磁珠与抗体偶联，出现一些问题，希望高人解答。不胜感激

1.与磁珠偶联之后的剩余抗体应该用哪种方法定量，BCA或Bradford？ 剩余的抗体溶液中含有pH9.5的硼酸缓冲液，也含有硫酸铵。

2.抗体在pH9.5的环境下是否失活，抗体能承受的pH范围是多少啊？
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北国毛毛雪[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用的什么磁珠？上面什么基团？
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30moonriver[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的磁珠是Dynal甲苯磺酰基，不知道你用的是什么磁珠？
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发表于 2013-10-25 22:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
尝试回答：1.BCA或者BRADFORD都是蛋白定量的方法，不过对溶液有要求，如盐离子浓度太高，影响结果准确性，如含有可被还原性物质，也影响结果。硼酸好像有还原性，硫酸铵离子浓度太高的话也不适宜。2.抗体一般在中性的溶液中保存比较稳定，如在短时间内，可以承受ph6-8的范围，如果ph相差更多，则时间越短越好，而且溶液偏酸比偏碱对抗体稳定性影响小。
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发表于 2013-10-25 22:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是偶联了亲和素的。
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birdfish[使用道具]
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发表于 2013-10-25 22:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

剩余的抗体溶液中含有pH9.5的硼酸缓冲液，也含有硫酸铵，铵在碱性条件下容易分解产生氨，可能会干扰偶连，所以最好去干净或换缓冲液。
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发表于 2013-10-25 23:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也正在做抗体与磁珠的耦联，但没想过要测耦联后剩余抗体的量，我做个抗体梯度，看到哪个量到达平台期，再判断哪个量是最适量。这样可否？
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-10-25 23:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
剩余的抗体溶液中含有pH9.5的硼酸缓冲液，也含有硫酸铵，铵在碱性条件下容易分解产生氨，可能会干扰偶连，所以最好去干净或换缓冲液。

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该磁珠的说明书上写到：Addition of ammonium sulphate to a final concentration of 1.2M(1.0-1.5M) will increase the amount of antibody coupled to the beads,and can give an improved performance in some applications.我觉得可能是因为我用的这种磁珠表面是疏水性的，而加入少量的盐能使抗体的疏水区暴露，更有利于抗体与磁珠的结合。但是含硫酸铵的硼酸缓冲液每次开盖用的时候都能闻到刺鼻的味道，可能真的分解产生氨了。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-10-25 23:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也正在做抗体与磁珠的耦联，但没想过要测耦联后剩余抗体的量，我做个抗体梯度，看到哪个量到达平台期，再判断哪个量是最适量。这样可否？

===============================================================================================================

我觉得这个方法可以找到最适量，可是在这种最适量的情况抗体也不可能全部连接到磁珠上吧？是不是应当计算出究竟有多少抗体连接到磁珠上，这样也就相当于测了偶联后的浓度。我是新手，也不知道是否一定要给出偶联率。
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2013-10-25 23:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

偶联率未必要给吧，我见文献上也没报道过，只能关于偶联效率的验证。况且我觉得BCA或Bradford测蛋白的量不是很可信，原因是我师兄用好几种方法测蛋白的量，相差都都大的，我不知道该信哪一种。
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