【转帖】从纯化到星辰---冷泉港(CSHL)蛋白质纯化...

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【转帖】从纯化到星辰---冷泉港(CSHL)蛋白质纯化...

38 1/4 1 2 3 4 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【转帖】从纯化到星辰---冷泉港(CSHL)蛋白质纯化...

zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2013-10-25 23:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标　题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（一）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 14:37:18 2005) WWW-POST

本文献给YL

引子
　2000年5月6日，我一个人在合肥三孝口书店闲诳,希望买点参考书带出国去。我注意到有一本翻译过来的书，书名叫做《蛋白质纯化与鉴定实验指南》。这本书很奇怪，里面列出了很多具体实验的步骤和解释。我很快意识到，这本书实际上是冷泉港实验室开设的一门《蛋白质纯化与鉴定》实验课的教材。这本书深深的吸引了我，因为里面记录的实验十分经典，涵盖了蛋白质纯化中可能用到的大部分手段，并且对实验细节有十分详尽的解释。我对这本书爱不释手，于是就买了下来, 而且当时就动了上这门课的念头。这是一个很模糊的想法，没有想到的是，五年以后这个想法竟然实现了。这一系列文章是我对这次上课经历的全面总结，一部分是八卦，一部分是流水账般的记叙，还有一些是从这课程学到的tricks, 最后也掺杂着自己过去做蛋白质纯化的心得。
想到哪说到哪，文字挺松散的，见笑了。
我来解释一下标题。课程结束之后，每一个学员都有一份证书，印着Per Pura Ad Astra 几个大字。这是拉丁语，直译就是”从纯化到星辰“　。原始的谚语是,Per AsperaAd Astra, 意思是through suffering to renown。所以“从纯化到星辰”实际的意思是，做好蛋白质纯化，以后就容易出人头地。呵呵。

--

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标　题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（二）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 14:44:32 2005) WWW-POST

本文献给YL

（二）同学和老师

　冷泉港的《蛋白质纯化与鉴定》培训班历史相当悠久，从1989年开始每年都开课，到今
年是第十六次。每
年都是四月初开始，持续两个星期。值得一提的是，冷泉港有相当多的培训班和会议，是
一个科学家交流和
学习的中心。这是冷泉港享有盛名的最主要原因。
　 2004年底, 我下定决心上这门课，于是递交了申请。二月份的时候的到消息，我被录
取了，并且还有
1000刀的tuition waiver。可我还是高兴不起来，因为还得解决1600刀(学费一共2600刀)
。老板人很nice,
但是他实在没钱了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解决了，去年的退税就这样全搭进去了
, 欲哭无泪啊。
　四月五号下午我赶到冷泉港，办完登记手续后被告知晚上七点全体开会，与教员和同学
见面。老师一共有四
个，每人负责一个模块的实验，持续三天时间, 每个老师都有一两个助手帮忙。学生则一
共有16个，分成四
组，轮转式的做完四个模块。我这一组其他三个人是:来自colorado Boulder 的chad,做有
丝分裂的;来自
Princeton的Adam,做海洋生物学的。Chad和Adam都是博士后。第三个是来自丹麦的Charlo
tte，是个博士
生，做植物的。
现在开始八卦一下几个老师，^_^
　总负责人是来自wisconsin-madison的Richard Burgess教授, 这老头很有意思，带这个
培训班已经带
了十二年了，到现在还是乐此不疲。他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他关系
很好，每年纯化
课的时候，watson都会跑到培训班的实验室找Burgess聊天，同时拉他去吃饭什么的。后来
的有一天，我
还真的看到了watson去找他聊天。不过令人惊讶的是，watson此人相当精神，走路象年轻
人。watson此
人口碑很不好，很自大。连Burgess教授一次和我们吃饭的时候都承认，watson有时候口无
遮拦，让他都
觉得很难堪。但是Burgess又承认watson对他自己的学生很支持，很提拔，这几年又尽心尽
力为冷泉港筹
款，贡献巨大。
　第二位教员是来自UCLA 的Albert Courey 教授。这位教授人很nice也很幽默，四位老师
中我对他印象
最好。申请这个课前，我先跟他发过e-mail 询问这个课的情况，而他也鼓励我申请。这老
哥研究果蝇的,
但是他却负责教一组纯化转录因子的实验。我一开始不太理解，后来问他的学术经历，才
明白是怎么回事。
原来这老哥博士是做生化，博后跟的是robert Tjian （钱泽南），还是做生化，研究转录
因子。后来做了
faculty之后，决定用果蝇做模型来研究转录因子。他那时侯不懂果蝇的遗传学，完全靠自
学和到处问人。
我知道后觉得特佩服，真正的科学家不应该被自己过去所受的训练束缚死了，应该是根据
研究的需要随时
准备学习新东西。这老哥虽然不是最年轻的，但是却很能跟上年轻人的潮流，比如他说他
有一个ipod
mini,还在网上itunes商店买过歌。我还跟他就ipod聊了一阵子，因为我也有个ipod。

第三位教员是来自Texas MD anderson cancer center的sue-hwa lin教授。她是一个
身材瘦小的中年妇
女，台湾人，特搞笑，非常喜欢给我们讲她博士后老板的笑话。一个笑话是这样的, 有一
天有一个学生向这
个老兄投诉说和实验室另一人有矛盾。这个老兄想了想，然后一本正经的说，和人产生矛
盾了，一般有三种
选择。第一种呢，就是既然你恨他，那就杀了他好了。那个学生听了之后，差点倒了。这
个老兄说看起来你
丫没这胆量，那还有第二种选择，就是杀了你自己。那个学生听了几乎要吐血。这老兄一
看乐了，然后说你既然没种杀人或者自杀，就剩第三种选择了, 就是ignore that guy!!!
哈。还有另一个笑话，sue-hwa lin的博士后老板虽然当了老板，但是还是喜欢做实验，并
且和一个博后共用一个bench。有一天那个博后指着这老兄的鼻子说，XXX呀，你把bench弄
得太乱了，赶快给我清理干净了。这老兄听了之后也不怒，而是慢条斯理的辩解说，每个
人都有自己喜欢的工作方式，我喜欢乱，你丫管我呢，要是不喜欢，我们可以在bench 上
画条线划清界线，从此井水不犯河水。哈哈哈。这老美连三八线都出来了。
第四位教授是rutgers university 的konstantin Severinov副教授，这老兄是俄罗
斯人，这四位老师中最年轻的一位。此君满头乱发，一脸大胡子，看起来很邋遢，所以一
开始我对他印象不佳。后来发现此人相当nice。Konstantin特搞，有一次他做报告，他的
电脑的桌面上有一堆乱七八糟的文件夹，其中有一个竟然是divorce!我告诉坐我旁边的一
个老美，老美说也注意到了，认为实在是很sad，呵呵。另外，他有两个未成年的儿子，喜
欢不断打他手机。结果他常常讲实验讲到一半就得停下来接电话。这个课结束之后，他还
跑到冷泉港书店买了一堆虫子毛绒玩具给两个儿子做纪念品。舔犊情深，可见一斑。

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标　题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（三）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 17:44:52 2005) WWW-POST

本文献给YL

zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2013-10-25 23:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

（三）不溶的sigma32

　　四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。这老兄研究了一辈
子E.Coli的RNA　polymerase。E.Coli RNA polymerase　核心酶是一个蛋白质复合体，只
有合成RNA的活性，却没有
识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合，从而实现转录。我
们这个实验
的核心主角就是其中一个因子，叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子
。Sigma 32
过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任
务就是要用变性
剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。
所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。我们先用1% Triton 来溶解细菌
本身的一些蛋白，
inclusion body 相当稳定，不溶于triton,所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。

　下一步就是用变性剂来溶解inclusion body。用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosy
l。sarkosyl(N-十
二烷基肌氨酸钠）是一种比较强的阴离子去垢剂, 0.3%的浓度就可以让包涵体溶解。sark
osyl的优点是，
虽然在高浓度下有变性作用，低浓度下却对蛋白质有稳定的作用。所以用sarkosyl做重折
叠之前的变性剂
是再好也不过的了。
　Burgess还要我们试了经典的 Gudn HCl（盐酸胍)来变性，作为对比。inclusion body
在这两种变性剂
下很容易就溶解了。然后我们得去掉变性剂，做重折叠。怎么做呢？方法有很多种，最简
单的是透析，把
变性剂全部换掉。这个方法Burgess并不喜欢，因为，透析是个缓慢的过程。在透析袋里面
，蛋白的浓度
还是很高。折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。另一种方法是突然稀释变性的
蛋白，由于蛋白
浓度相对与透析低了很多，好一点。但是问题也是类似的。Burgess提议用逐步滴加稀释的
办法。就是放
一大烧杯的缓冲液，里面有一个磁石可以不断混合液体，然后一滴一滴加入变性的蛋白溶
液。由于烧杯里
的溶液蛋白量是逐渐增加的，所以一开始蛋白折叠中间产物能够相互作用的几率大大降低
了。Burgess说的
还真象那么回事，可事实上，嘿嘿。我们先用试着重折叠Gudn HCl溶解的Sigma32。一开始
还好，滴到
后来，溶液就变浑浊了，最后几乎成了冲淡了的牛奶那样的东东。Burgess脸色不好看，说
不应该这样的。
我们一离心，沉淀出来一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清跑了一个Poros HQ 50阴离子交换
柱，拿到的蛋
白很少，回收率小于5%。失败啊。
　从这里开始，我要岔开一下，讲一些跟这个模块实验没太大关系，但是很有意思的东西

--
发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标　题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（四）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 17:50:21 2005) WWW-POST

本文献给YL

zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2013-10-25 23:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

（四）Hydrostatic pressure和跑小柱子的trick

　　 Dr. Burgess 假定我们对蛋白质纯化一无所知，所以讲得很细致。比如他特别提到了
disposable
column的用法。这种小柱子很简单，把beads倒进去，冲洗一下就可以用来纯化蛋白了，很
方便。
唯一的问题是，由于是依靠重力跑，速度有时候会十分慢。液体流经柱子速度由hydrosta
tic pressure
(静流体压力）来决定。而hydrostatic pressure又是由实际柱高(即液体经过的长度)来决
定。如果你
嫌液体流得太慢（尤其是洗柱子的时候），可以在柱子下端出口连一个长的塑胶管子或者
针管，这样速
度会快很多。这是很简单的小trick, 但我觉得对初做蛋白质纯化的人还是很有帮助的。

　　我知道一个例子。我原来很喜欢女生A, 有一天晚上主动等在她实验室等她做完实验，
就开车送她回家。
这一等不得了，从晚上七点等到了凌晨一点。这个过程中，她好像没什么事情，但是每隔
20分钟，她就会去
一次cold room。作完实验了之后，我好奇的问她，到底是什么试验花了这么长时间，结果
她说她在用一个disposable column纯化蛋白，由于beads 稍微多了一点，速度很慢，而p
rotocol有一步要求用数百毫升
的洗液来冲洗柱子。所以她每隔二十分钟就去加洗液，所以白白花了好几个小时。我听了
之后都要ft了,没想
到她们实验室竟然没有人告诉她, 有简单的办法可以让柱子跑得快一点的。只要在下端出
口加一个长管子，
她至少可以少等两个小时。　
当然最简单的办法还不是这个，最简单的办法的是把盛有洗液的容器放高，然后
利用虹吸的原理让液体
源源不断的流经柱子。同时，柱子的下端连上塑胶管，弯成一个连通器，这个连通器的高
度应该略高于柱面，
这样冲洗结束后，柱子就不会干。如果用这种方法，A就不用在实验室待一晚上了，因为一
切都是自动完成的。
　我现在跟A已经完全没有来往了, 但我对她映象还是十分深刻，主要就是因为她那晚
跑柱子的经历。话撤
远了，现在再回到蛋百质纯化课。

--
发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标　题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（五）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 17:57:06 2005) WWW-POST

本文献给YL

（五）"万金油"buffer
　 Dr. Burgess 这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国
最早用
coomassie blue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章
,讲述
一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写
了一
封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。
　不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜
欢用这
个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer, 可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他
吹得神
乎其神，配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是这样
的:

50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol　　

zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2013-10-25 23:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Tris EDTA NaCl 这三样都没什么，真正关键的是5%glycerol。有了这个glycerol, 很
多蛋
白，尤其是酶会十分稳定。这个稳定的效果是十分惊人的。Dr.Burgess就此跟我们讲了他
的
经历。六十年代的时候，他还是个小博士后，在watson 实验室里干，主要是纯化细菌RNA

polymerase的各个亚基。那时候一个大问题是RNA polymerase纯化出来后十分不稳定, 放
冰
上, 过30分钟，活性还会损失一半。Burgess有一次不小心出了错误，把纯化出来的RNA

polymerase和glycerol 混合了。结果意外发现，RNA polymerase 变得十分十分的稳定。

稳定到什么程度呢,就是你把这个酶加上50%glycerol，用平信从美国寄十几天到澳洲，活
性还
有7~80%！另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫键，加一点DTT，防止蛋白形成

非天然的二硫键, 也会对蛋白质的稳定有好处。
　为了让我们对这个 "万金油"buffer的好处有感性认识, Burgess设计了一个实验让我们
做。
他之前已经准备好了在大肠杆菌中表达的GFP包涵体(inclusion body)。我们把包涵体分成
两部
分，一部分用guanidinium hydrochloride（盐酸胍）溶解变性，另一部分用sarkosyl

(N-十二烷基肌氨酸钠）溶解变性。然后把这些溶解的GFP溶液分到一个96孔板上,每个孔1
0微升，
然后加入２０倍的refolding buffer 来稀释，稀释了之后，变性的GFP就开始重折叠。我
们有一
个hampton 卖的refolding 试剂盒，内有十几种不同配方的refolding solution。我们试
了所有这
些buffer 同时还试了TGE, TGE+15% glycerol, TGE+35% glycerol, TGE+45% glycerol,这
四种
buffer。由于GFP折叠好了才能发荧光，用一个fluorescence plater reader，我们可以实
时监控折
叠的效果。结果让人很吃惊，Hamton卖的这个试剂盒，虽然配方都很fancy,但是一塌糊涂
，没有
一种溶液能让GFP重折叠的很好。相比之下，TGE的四种溶液都很好，GFP重折叠的效率是h
ampton
kit的几十倍。最强的是TGE+35% glycerol。
另外，不论是用Gudn HC变性还是用sarkosyl来变性，TGE+glycerol 的重折叠的效果
都很好。
实验结果出来后，看着我们惊讶的表情，Burgess脸上都笑开花了，呵呵。这个实验我还学
到的一
个教训是,不能迷信商业化的kit, 很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用

--
发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标　题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（六）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 18:08:46 2005) WWW-POST

本文献给YL
（六）兴风作浪的乳糖(lactose)

zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2013-10-25 23:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

（六）兴风作浪的乳糖(lactose)

　晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告
是后来才听到的，
但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌钟表达蛋白的，我把这一段提前来说说。S
tudier这老哥是
Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7 噬菌体，也是T7 RNA polymerase ind
uction
system(pET 系列质粒)的发明者。
T7 系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不
可能不知道这个
系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被
T7 RNA
polymerase 识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株,染色体里面已经
整合入了由
LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase 基因片断。如果在细菌培养基里
面加入
IPTG, 来诱导T7 RNA polymerase 的表达，就可以启动目的蛋白的表达。这个系统非常强
大，原因
在于T7 RNA polymerase工作起来非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表达一个蛋白，
表达量可以
占到大肠杆菌总蛋白量的50%! 大家可以想象，这种系统虽然很强大，但是表达量太大，对
大肠杆菌有
毒性，造成的结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。
这一点我深有体会。我曾经想用细菌表达一个蛋白,而且估计这个蛋白会形成包涵体
。妖怪的是，用质
粒转化蛋白表达菌株BL21(DE3)怎么也不能转化，铺的板一个菌落也没有。我当时就怀疑是
因为表达的
蛋白对大肠杆菌有毒性，仅仅是本底的一点表达就足以杀死细菌。我来来回回一共转化了
五六次，最后
终于找到了唯一的一个菌落。虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首，但是我没有仔细想
过本底是怎么
来的。
这个问题到了bill studier做报告之后，才真相大白。原来我们一般用的LB broth有
三种成分，其中一
种是tryptone. Tryptone是caseine的酶解产物，而casein又是milk里提取而来。由于mil
k 有乳
糖(lactose)，tryptone里面也有乳糖的污染。Bill studier研究发现即使很微量的lacto
se也能有效的诱
导蛋白表达。原来如此！！！
　所以要解决我原来的那个问题，用一种不含有乳糖的media做培养板就完事了。有意思
的是，细菌有
一种很有意思的特点，如果培养基里有足量的glucose，细菌会优先摄取glucose,　而不能
摄取lactose。
Bill studier　根据这个特点研究出一种可以自动诱导的培养基。这种培养基含有成比例
的glucose 和
lactose。细菌首先摄取glucose，不摄取lactose,当细菌长到一定密度，耗完glucose之后
，就开始摄取
lactose,从而开始诱导表达。所以用这种培养基养菌，很省事，接种了第二天收细菌，提
蛋白就行了。
　最后Bill studier老爷子特别强调的是细菌的供氧。氧气是限制细菌生长最重要的瓶颈
, 如果有足够氧
气在培养基里面, 大肠杆菌的密度可以从一般的OD600 2~3 翻十倍到20~30!　要提高培养
瓶的供氧，
可以用baffled flask。这种flask的瓶底边缘有几处凹陷(类似于可乐塑料瓶底那样的形状
)，能有效增加
空气的培养基的混合。
最后，详细内容可以见下列文献:
Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005)

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标　题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（七）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 18:15:35 2005) WWW-POST

本文献给YL

zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2013-10-25 23:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

（七）古怪的CDC6

　这里再给大家讲一个在大肠杆菌中表达蛋白质的例子，一个很夸张的例子，但是很有
启发性。
　　Bruce Stillman 是冷泉港的现任主管，是一个绝对的牛人。不但科学做得很好，而且
还很爱
国。他是澳洲人，在美国待了N年，却从没有加入美国国籍，所以他只是外籍院士。我们的
晚间报
告有一个是他作的。他主要研究真核生物的DNA复制。这是一个到现在为止都没有完全弄明
白的领
域。在报告里面，他特别提到了表达纯化CDC6蛋白的经历，我觉得十分有意思。这个蛋白
, 用他
的话说，是"a pain in the ass"。
　CDC6是干什么的呢？这要从ORC说起。真核生物的DNA有多个复制起始位点(replicati
on
origin)，ORC(Origin Replication Complex)是一个很大的蛋白复合体，可以识别这些复
制起始位
点。ORC在整个细胞周期里面都是与DNA结合的。在G1期里面，CDC6这个蛋白会与ORC结合，
同
时让MCM(DNA解旋酶)也装载到ORC上，形成一个pre-replication protein complex。这个
complex
一旦形成，DNA 复制的准备工作就完成，只等其他kinase的激活，细胞从G1进入S期，复制
就开始。
　Stillman 实验室一直想表达酵母的CDC6和ORC的重组蛋白，然后做结构研究。但是到了
CDC6，他们
碰到了大麻烦。首先他们尝试真核系统来表达，但是意外的是，他们发现表达出来的CDC6
完全没有活性。
然后他们尝试用大肠杆菌来表达。首先发现37度诱导表达出来的蛋白不溶，重折叠也没有
用。然后他们尝
试在室温下诱导表达，发现蛋白虽然可溶了，但是都被降解了。然后呢，他们就想到了加
一个GST tag,这
下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是还是没有活性。他们估计是因为GST可以形成
dimer，干扰
CDC6的正常功能。所以呢，他们重新做了一个construct,在GST和CDC6序列中间加了一个蛋
白酶切割位
点。正当他们满心欢喜的以为问题解决了的时候，意外又出现了。有GST的CDC6是可溶的，
可是一旦把
GST切掉了，CDC就沉淀出来了....@#%#^&%$^#!!!
几乎是山穷水尽了，但是做这个project的博士后还是没有放弃希望，他做了最后的
孤注一掷。他猜到
这个蛋白可能很不稳定，对缓冲液要求可能很高，所以他让一个本科生连续试了十多种bu
ffer，最后发现
如果用磷酸钾＋谷氨酸钾缓冲液，切掉GST之后CDC6就不会沉淀了。Stillman认为谷氨酸根
和磷酸根跟
氯离子相比更接近与核酸, 可能让CDC6更稳定。这个CDC6一共花了他们18个月时间, 却就
这一点小trick!
这以后，他们表达的CDC6都有活性了，后来做了一系列的电镜三维结构重构实验，研究CD
C6和ORC的
复合体结构。Stillman实验室正在准备一篇文章要投到nature上去。大家等着看把。

--
发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标　题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（八）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Fri Apr 29 11:14:36 2005) WWW-POST

本文献给YL

zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2013-10-25 23:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

（八）”液体DEAE“

　绕了这么大一圈，现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们

试Gudn HCl溶解sigma32之后的重折叠，结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做
变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似，只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果

好了很多，至少没有浑浊现象了。接着我们用Poros HS 50，一种阳离子交换柱，
来把可溶的sigma 分离了出来。为什么这一次用Poros HS 50 而不是前面用的阴离
子交换柱呢？因为sarkosyl带负电，会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32
很奇怪，既有负电的表面，又有带正电的表面，所以可以用阳离子交换柱。值得一提

的是绝大部分蛋白质都是偏酸性，所以阴离子交换柱用的比阳离子交换柱频繁得多。

　　好了，聊完离子交换柱，现在回到Dr Burgess要我们作的另一个很重要的实验。

Sigma32在大肠杆菌过表达的时候，绝大部分都是inclusion body,但是也有一部分
是可溶的。这些可溶的sigma 32可以和细菌体内的Core RNA polymerase结合形
成复合体。我们这个实验就是要把这个复合体纯化出来。核心办法是用免疫亲合柱来

纯化。但是为了提高纯化的效果，Burgess要我们提前用PEI沉淀的办法来粗分一下。

PEI 是什么呢？就是polyethyleneimine （聚乙烯亚胺）。这个东东我过去没碰到，

所以很感兴趣。PEI呢是一个带正电的polymer，和酸性蛋白质和核酸结合以后聚合
体沉淀出来。由于这种结合是受离子强度影响的，感觉上很象DEAE那之类的性质，
所以Burgess称之为"液体DEAE"。RNA polymerase和DNA是结合的，所以PEI沉
淀DNA的同时，把RNA polymerase+sigma32都沉淀了下来。然后再用高盐洗脱
蛋白质，而DNA和PEI结合很紧密，所以还是在沉淀里面。这样一来，好多垃圾蛋白
和核酸都被去掉了。到了这一步，还有一个问题。就是洗脱下来的蛋白里面还有PEI,

如果现在就用透析的办法降低盐浓度，PEI和蛋白会重新形成沉淀。所以下一步就是
用硫酸胺沉淀的办法把蛋白和PEI分开。用低盐buffer重溶沉淀的蛋白,过免疫亲合柱
就行了。免疫亲合柱就没有什么好说的了。最后结果很不错，跑胶后用coomassie
blue 就可以清楚的看到RNA polymerase的各个亚基。

--
发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（九）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Sun May 1 22:44:00 2005) WWW-POST

本文献给YL

zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2013-10-25 23:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

（九）沉淀，沉淀，沉淀

　　上一部分我匆匆提到了用蛩岚背恋来去掉PEI(Polyethyleneimine）的步骤。
不常做生化的同学可能对蛩岚背恋的方法不熟悉。但其实这种沉淀是蛋白质纯化中
及其重要的一种方法。说实话我过去也很少接触，但是在这个课里面，四组实验中有
三个都用到了这个方法，可见其重要性。
蛩岚背恋是怎么做的呢?其实很简单，把磨细了的酸氨粉末往样品溶液里
倒就行了，蛋白就会相继沉淀下来。由于不同的蛋白，在不同的硫酸氨浓度下被分
别沉淀下来，这种方法把蛋白质样品粗粗的分离一下。这种方法对大量样品尤其好
用，因为比较方便快捷便宜。硫酸氨沉淀的优点是什么呢？最大的优点是这东西虽
然能让蛋白质沉淀下来，但是不会让蛋白质变性，所以沉淀下来的蛋白质一般可以
重新溶解。
　　其实沉淀蛋白质的方法有很多种，但是对于娇贵的蛋白质来说，很多常用方法
都太harsh了。我举两个例子把：TCA沉淀大家都熟悉的。TCA是个强酸，施放出
来的质子中和了蛋白质的负电荷，只留下正电荷与TCA形成不溶物，从而变性。
丙酮沉淀，通过改变介电常数来降低蛋白质的溶解度，从而沉淀，由于丙酮一类的
有机溶剂可以与蛋白质的疏水表面相互作用，所以沉淀的同时，蛋白质也会变性。
蛩岚背恋的机理是什么呢？简而言之就是盐析（salt out）。蛋白质在溶液里
面溶解度和盐浓度有关系。在低盐浓度下，如果增加盐浓度，会增强蛋白质的溶解，
这是因为，盐的离子与蛋白质表面的正负电荷配对，减少了蛋白质电荷表面相互作用
的机会。当盐浓度高到一定程度的时候，过多的盐会跟蛋白质疏水表面争夺水分子，
以至于蛋白质疏水表面倾向于相互作用形成聚合物沉淀下来。
×蛩岚比绻?擞玫暮每梢帮很大的忙。Dr. Burgess讲过一个例子。他有一年去
一个公司做sabbatical。这个公司是做单抗的，有一个工序是要从ascites fluids 里
头把抗体给纯化出来。这个公司用蛩岚背恋的方法来粗分蛋白。Burgess很惊讶的发
现，这个公司竟然没有做仔细的分析，就随便用了一个很高的硫酸氨浓度，结果把抗
体和serum albumin一起沉淀了。但是其实可以用一个低一点的浓度，只把serum
albumin沉淀下来，从而把抗体和serum albumin分开。Serum albumin浓度是非常
高的了，这样一分，大大提高了后续纯化步骤的效率。
Dr. Burgess强调说，用什么浓度把什么蛋白沉淀下来，完全是经验性的，而且每
次都不一定能重复的。因为是否能沉淀下来跟蛋白质浓度有关系，而每次样品内目标
蛋白的浓度不一定一样。有一个很简单的方法可以用来估计蛋白质沉淀所需酸氨的
浓度。把样品分成五份，每份分别加酸氨至20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 离心去掉沉
淀，保留上清，再向上清里面添加硫酸氨使浓度从20%到30%, 30%到40%, 40%到50%,
50%到60%, 60%到70%，离心保留沉淀，然后分析沉淀里的蛋白, 看看目标蛋白到底在
哪里，就完事了。

社会主义好[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 79862
精华 0
积分 184
帖子 128
信誉分 100
可用分 1371
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态离线

发表于 2013-10-25 23:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很有启发，其实纯化本身就是个经验性很强的技术，需要敢于尝试，也得多看文献开阔思路。

wu11998866[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73743
精华 0
积分 569
帖子 797
信誉分 100
可用分 4850
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态离线

发表于 2013-10-25 23:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

D.R.Marshak , J.T.Kadonaga et. al.《Strategies for Protein Purification and Characterization: A laboratory course manual》Gold spring Harbor Laboratory Press,1996
国内有中文版的，科学出版社，朱厚础等译,些医学书店就有，现在见得少了。是本很实用的书，但是色谱方面的偏少一些，可以看 Richard J.Simpson《Purifying Proteins for Proteomics :A Laboratory Manual》,色谱纯化原理等写得很全面，这两本书合起来看其实纯化也就相对比较熟悉了。后面的书国内是影印版的。现在此书比较常见。<生物工程下游技术>这本书也不错.
很赞同帖子上的一句话，那就是：“不能迷信商业化的kit, 很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用”。蛋白纯化有很强的个性，没有一成不变的方法，就连洗脱方法都是这样的。

38 1/4 1 2 3 4 ››