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标题:【求助】关于总蛋白提取的一个初级问题

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发表于 2013-10-26 20:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于总蛋白提取的一个初级问题

我是一个初学者，请高手指点蛋白质提取的 protocol。对于裂解液中各种成分的配制，有什么要求？这些成分各有什么作用？尤其是蛋白酶抑制剂怎么用？

另外用Trizol提取RNA的同时，提取到的蛋白质质量如何？有什么优缺点？

我的实验目的是提取精子中的总蛋白做Western-blot。

谢谢大虾指点!
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-10-26 20:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白的提取方法要适应于你以后的试验，所以不同的试验目的，所要的蛋白提取方法不一样。
2－D 的裂解液：4％CHAPS、2％IPG buffer、8M urea、60mMDTT、1mM PMSF、0.01M Tris.cl pH 7.4
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lixi559[使用道具]
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发表于 2013-10-26 21:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

通常裂解液有好多种如单去污裂解液,三去污裂解液等.很多时候我们一般选择三去污裂解液,因为它不温不火.裂解液一般要求含几种去污剂和几种蛋白酶抑制剂.其中叠淡钠是防腐用,SDS,TRitonX-100 ,去氧胆酸钠是离子或非离子去污剂.aprotinin,PMSF Leuprotin等\是蛋白酶抑制剂.Trizol一般仅提取RNA.
建议这位朋友去看看<<分子克隆>>那本书,里面讲的很详细.另外,由郭尧君写的<<蛋白质电泳实验技术>>讲Western-blot讲的很清楚.
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9900[使用道具]
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发表于 2013-10-26 21:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢二位大虾指点！

我看到的两篇关于精子中总蛋白提取的文献中所用的裂解液不完全相同，我现在列这里，请各位大虾予以点评。我不知道我该怎么配制我的裂解液，请大虾指点。谢谢！

裂解液 1：
lysis buffer [62.5 mmol/liter Tris-HCl (pH 6.8), 50 mmol/liter dithiothreitol, 2% SDS, 10% glycerol, 1 mmol/liter Na3VO4, 1 mmol/liter phenylmethylsulfonylfluoride].
裂解液 2：
lysis buffer [100 mmol/l Tris-HCl, pH 7.4, 20% glycerol, 150 mmol/l KCl, 1 mmol/l dithiothreitol, 1 mmol/l EDTA, containing one protease inhibitor tablet(Roche, Germany)/10 ml buffer].
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ffooll[使用道具]
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发表于 2013-10-26 21:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果仅是真核细胞，双去污的效果就很好了。一般的叠淡钠是防腐用,SDS,TRitonX-100 ,DOC，NP40 etc.是去污剂.Aprotinin,PMSF Leuprotin等是蛋白酶抑制剂.通常有PMSF和胰蛋白酶抑制剂aprotinin足以！
我个人觉得裂解液 1使用了SDS，由于其结合是不可逆，后续步骤难以除去。而2则是应用高盐150 mmol/l KCl增加胞膜内外渗透压破坏双脂膜。不解的是，为什么这里要加上高浓度的甘油？另外dithiothreitol，me等还原剂也是不提倡加的。
根据细胞裂解的情况（看胞膜碎片的量）观察所选择的去污剂效果，并及时调整方案，当然要在不破坏目的蛋白的基础上（后续检验）。
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发表于 2013-10-26 21:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道别的大虾还有什么看法？
另外，裂解细胞时，裂解液按多少量来添加？
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caihong[使用道具]
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发表于 2013-10-26 21:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果我 需要提取总蛋白，同时希望尽可能多得得到膜蛋白，然后western检测，大家可以帮我看看这个裂解buffer合适吗？我是初学者，希望大家多指点

裂解bbuffer：
50mM HEPES ph7.0
1mM 甘油
1mM DTT（还原剂）
7M 尿素，2M硫脲(是不是可以提高膜蛋白的融解）
1mM EDTA(金属鏊合剂）
1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin，1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制剂）
50mM NaF(ph7.0)这个试剂不懂）
1mM Na3VO4(ph7.0)（这个试剂不懂）
2mM benzamidine（这个试剂不懂）

然后16.000g 离心15分钟
上清－80度保存
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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-10-26 21:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

裂解细胞时，裂解液按多少量来添加？

裂解液一般为细胞体积的10-20倍；
对于你的两个裂解液，我个人认为第一个比较好一些，因为第二个中盐浓度相对第一个要高一些，这样就可能在跑PAGE时出现条带呈波浪形的问题。不知对否。
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克隆鱼[使用道具]
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发表于 2013-10-26 21:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看了大家的讨论，我感觉裂解液如果加20－30倍是否太多了，我做过一次结果蛋白浓度太低，做电泳时上样比较多，条带很不好看，不知道是不是有关系
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