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标题:【求助】western半干电转的参数设置

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发表于 2013-10-26 21:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western半干电转的参数设置

我用20v70min半干电转后，胶染色仍然不完全，不知一般是多少？（145KD,另一个是45KD)
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发表于 2013-10-26 21:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
缓冲液没对吧，我们都只用15分左右就足够了
Western transfer using a semidry apparatus
cuturl('http://grimwade.biochem.unimelb.edu.au/bowtell/biochem/sect31.htm')
cuturl('http://www.med.unc.edu/wrkunits/3ctrpgm/pmbb/mbt/WESTERN.htm')
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发表于 2013-10-26 21:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上次转了70min，胶染色仍然有蛋白，不知为何？
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发表于 2013-10-26 21:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
根本要不了70分，BIO-RAD体系推荐小胶电压10－30V, 大胶20－30V，10－30分或据染色预试决定，但通常不超过30分；缓冲液和电流很重要，不管半干或全湿转移缓冲液都是不需调pH的，越调越乱，千万不能短路；若分子量大可在20很后适当提高电压同时减低或不用甲醇。
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发表于 2013-10-26 21:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我查了资料，上面说半干电转用1.2mA/cm2，那么小胶大概是35mA/h。但是我看我们实验室的仪器有恒压和恒流两种选择，我们常常用恒压（20v），恒流时我调了一下，最大可达到2，但不知单位是A还是mA.今天两块胶一起转（每块7×5cm），20v90min，停30min（防止温度过高），再继续30min。但对胶染色发现仍然有很明显的条带，说明转移不完全。真不知如何是好。
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发表于 2013-10-26 21:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多用的是恒压，145KD和45KD差别大，不可能完全转尽；等145KD转尽45KD的早就过膜了；实在不行换湿转算了，效率高些
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发表于 2013-10-26 21:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

高分子量蛋白可能在离开胶之前就丧失了SDS，增加转移时间也不会增加转移效率。降低缓冲液的甲醇浓度和离子强度，增加电流强度有利于高分子蛋白的转移。低分子蛋白移动很快，在到膜时仍有部份SDS未脱离，结果就穿膜而过。要使现两个蛋白都高效转移到一张膜上，难度较大。可能的解决办法：放两层膜。上层膜用0.45，下层用0.20 。
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发表于 2013-10-26 21:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位。
145KD的我已作出来了（1月前）。
现在正在做45KD的，今天结果：背景强，特异条带不明显。所用参数:电转如上面的帖子，一抗1：100 120min； 二抗：1：5000 80min。化学发光2min。用伊犁脱脂奶粉封闭。
请大家指导。我准备下次只有用湿转了。
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发表于 2013-10-26 21:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

湿转45KD,恒压100V 30分到40分即可，监测电流不要超过250mA，否则可能有短路的嫌疑；在铺膜的时候注意排除干净气泡，并注意不要用手直接接触膜，以及新鲜的转移缓冲液，否则显色后会产生指纹和不必要的污点；若特异性可，可适当减少显色时间，若条带不明显，可适当减少封闭的时间或干脆不封闭，一抗孵育可视实际的情况4oC过夜。
一二抗的稀释度都差不多
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发表于 2013-10-26 21:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我要检测的蛋白质分子量是72KDa的基质金属蛋白酶，采用全湿转移，350mA，1小时，结果考马斯亮兰染色胶上仍见较浓的条带，一抗1：2000，单克隆，4度孵育10小时，化学发光法检测，能否出结果，今晚才知道。各位专家多指导！！
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