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标题:【求助】western跑胶后染色有拖尾和不均一

mysmdbl[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western跑胶后染色有拖尾和不均一

请问可能是什么原因造成的？
用的胶是invitrogen的4-12% BT预制胶，样品之前用自己配制的胶可以做出结果，改用预制胶后一直有条带不均一或者拖尾现象，样品是组织样品，碧云天的RIPA裂解提取，SDS上样缓冲液变性10min。（因为没脱色完全，调整了一下颜色，但是条带基本是这样。）


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2013-10-26 23:08
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发表于 2013-10-26 23:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电解液是多久换的啊？是不是因为电解液的原因呢？还有你说以前自己配的可以做出来，样品应该没问题
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发表于 2013-10-26 23:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电泳液是invitrogen的，裂解液是碧云天的，公司说marker跑的可以，可能是组织裂解不完全，或者盐分过高，样品上样量大，但是也不知道具体是哪种。
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发表于 2013-10-26 23:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

样品制作问题比较大。重新做sample吧
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发表于 2013-10-26 23:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品里有沉淀，尤其是左边数第一道，和右边数第二道，虽然和之前做出结果的样品为同一份，但可能样品放置时间过久，建议你重新做上样品，变性完可以再加适量的还原剂，推荐你用DTT，尽量不要用2-ME~~
另外中间一道上样量貌似偏多~~
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发表于 2013-10-26 23:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这几例是新收集的标本，离心一下会有帮助吗，碧云天里的上样缓冲液DTT和2-ME都有，要重新配吗
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发表于 2013-10-26 23:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

离心没用，只有重做。
碧云天的再试试，不行就换。
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发表于 2013-10-26 23:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主：是什么组织，能否把提取蛋白的细致过程说一下，还有楼主制胶的时候，所取各组分是否混匀，重新配置电泳缓冲液和重提蛋白。
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发表于 2013-10-26 23:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
肝脏组织，切碎组织，每20mg 加RIPA 200ul，冰上裂解30分钟以后超声匀浆。用的是invitrogen的预制胶和电泳液。就是不知道样本有什么问题，因为换了第二批做还是这样。
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发表于 2013-10-26 23:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

两个原因
1.样品处理的不好，裂解后离心，小心取上清。
2.电泳电压太大，进入分离胶后电压不要太高。

另外提醒一句，组织液的处理操作要认真仔细。
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